質(zhì)粒的提取及鑒定2

質(zhì)粒的提取及鑒定演示文稿當(dāng)前第1頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)優(yōu)選質(zhì)粒的提取及鑒定ppt當(dāng)前第2頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)目的要求了解質(zhì)粒的概念。熟悉提取質(zhì)粒的基本原理。掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。當(dāng)前第3頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)a.什么是質(zhì)粒（plasmid）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.質(zhì)粒的用途有哪些？41.關(guān)于質(zhì)粒的概念當(dāng)前第4頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。

5當(dāng)前第5頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)線狀DNA(linearDNA,LDNA):

如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。（3）開環(huán)DNA(opencircularDNA,OCDNA)

如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。質(zhì)粒的三種構(gòu)型6當(dāng)前第6頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)質(zhì)粒DNA的一般特性：(1)宿主菌染色體DNA通常比質(zhì)粒DNA要大得多(2)它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。(3)質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子,有相對(duì)獨(dú)立性。(4)它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型：菌毛、抗藥性等

當(dāng)前第7頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)分離純化質(zhì)粒DNA的主要步驟(1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增（DNA的擴(kuò)增與選擇）(2)細(xì)菌的收集與裂解

收集方法：高速離心的方法裂解細(xì)菌方法：去污劑法、有機(jī)溶劑法、堿變性法、沸水熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的純化方法等因素綜合后加以選擇。

(3)質(zhì)粒DNA的純化

常用的方法有：超速離心、層析法、聚乙二醇沉淀法等所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。2提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的方法和原則當(dāng)前第8頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)原理示意圖當(dāng)前第9頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理：高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放①染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA；②線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。①質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并用除去殘留的蛋白質(zhì)當(dāng)前第10頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)試劑盒主要試劑及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?HCl組成.(保護(hù)、緩沖)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用)②EDTA

的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）③Tris?HCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）11當(dāng)前第11頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成(裂解、變性)①SDS是離子型表面活性劑,其主要作用是：溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白；使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便后續(xù)更好地進(jìn)行。②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）可瞬間溶解細(xì)胞及細(xì)菌。12試劑盒主要試劑及作用當(dāng)前第12頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)溶液III：pH4.8KAC(乙酸鉀)高鹽溶液，pH調(diào)至中性

(復(fù)性，分離)①中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。試劑盒主要試劑及作用當(dāng)前第13頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)吸附株純化質(zhì)粒DNA當(dāng)前第14頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟1.收集4.5ml菌液于EP管，每次12000g×30s

2.棄上清，加含RnaseA溶液I250μl，劇烈振蕩3.加250μl

溶液II，快速顛倒數(shù)次

4.加350μl溶液III，溫和振蕩10s，12000g×10min5.轉(zhuǎn)移500μl上清到吸附株，12000g×1min

6.吸附柱中加700μl漂洗液，12000g×1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。7.向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000g×1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。12000g×2min，8.將吸附柱敞口置于室溫放置2min，揮發(fā)殘余的乙醇。9.將吸附柱放入一個(gè)干凈的EP管中，向吸附膜中央懸空滴加50μl經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000g×1min。10.將此質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃保存。當(dāng)前第15頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)

瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

在堿性環(huán)境下，DNA的磷酸基團(tuán)解離，使DNA帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因各種DNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，在通過凝膠立體網(wǎng)格時(shí)所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。

163、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定當(dāng)前第16頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料及試劑

6xloadingbuffer：主要成分甘油、電泳指示劑和tris.甘油主要負(fù)責(zé)沉降DNA，避免飛樣。指示劑肉眼可見，確定電泳狀態(tài)，一般指示劑兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，甲苯晴呈藍(lán)色。溴化乙錠（EB）：熒光染料，可與DNA結(jié)合，在紫外光照射下呈紅橙色熒光。有致癌性。TBE:Tris，Boric

acid,EDTA。核酸電泳的經(jīng)典緩沖液。瓊脂糖：用1xTBE配置瓊脂糖凝膠。DNAmarker當(dāng)前第17頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)DNAMarker：是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問題，以及粗略判斷樣品的分子量。DNAMarker應(yīng)選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密集的marker，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)較準(zhǔn)確。當(dāng)前第18頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)影響DNA在凝膠中遷移速率的因素

1DNA分子的大小2構(gòu)象3凝膠濃度4電壓5緩沖液當(dāng)前第19頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)OC型質(zhì)粒DNA點(diǎn)樣孔細(xì)菌基因組DNAL型質(zhì)粒DNASC質(zhì)粒DNA細(xì)菌RNA質(zhì)粒電泳圖譜當(dāng)前第20頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠待溫度降至60-70℃時(shí)加入EB（0.5μ/ml）、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒DNA樣品液5μl+1μl上樣緩沖液，混勻）電泳（100V20min左右，5V/cm）紫外燈下檢測(cè)當(dāng)前第21頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)移液器的使用將微量液體從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器的計(jì)量器具，我們稱之為移液器。當(dāng)前第22頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)移液器的使用移液循環(huán)安裝槍頭設(shè)定容量吸液放液卸去槍頭當(dāng)前第23頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)移液器的使用安裝槍頭當(dāng)前第24頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)移液器的使用原點(diǎn)第一停點(diǎn)第二停點(diǎn)勿在液體中按至第一停點(diǎn)槍頭勿伸入液面太深管壁加入排盡液體復(fù)位后，卸去槍頭當(dāng)前第25頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)移液器的使用卸去槍頭無需用手接觸槍頭當(dāng)前第26頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)

1、加樣槍正確使用；2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型；3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要換槍頭；5、離心前把管擦干；6、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀；7、使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁；8、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。9、洗脫液不少于50μl，-20℃保存，以防DNA降解。質(zhì)粒提取注意事項(xiàng)：當(dāng)前第27頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)1.凝膠濃度選擇根據(jù)樣品DNA分子大小而定，所以電泳前應(yīng)對(duì)DNA片段大小有粗略估計(jì)。2.加EB時(shí)，膠的溫度不要太高。高溫會(huì)導(dǎo)致EB揮發(fā)，EB有致癌性。倒膠時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。3.緩沖液要完全沒過點(diǎn)樣孔。點(diǎn)樣孔不能有氣泡。4.紫外線照射不要太久。尤其避免直接照射皮膚。瓊脂糖電泳注意事項(xiàng)：當(dāng)前第28頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。

29當(dāng)前第29頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)基因克隆示意圖分、切接轉(zhuǎn)篩實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)，又稱基因工程。當(dāng)前第32頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)當(dāng)前第33頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)2BamHI、HindⅢ酶切質(zhì)粒及鑒定2.1實(shí)驗(yàn)原理：利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNA片段，通過電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒DNA）34當(dāng)前第34頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)七質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的濃度測(cè)定與雙酶切鑒定天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系辛靈彪當(dāng)前第35頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)1.熟悉DNA的濃度測(cè)定方法。2.了解限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用。3.熟悉利用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的方法。目的要求當(dāng)前第36頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理1.質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定當(dāng)前第37頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應(yīng)用當(dāng)前第38頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)DNA樣品的濃度（μg/μl）=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000OD260/OD280打開紫外分光光度計(jì)，設(shè)定波長(zhǎng)260nm,切換至紫外。1.質(zhì)粒DNA濃度測(cè)定方法200倍稀釋樣品，10μl質(zhì)粒加水稀釋至2000μl洗凈比色皿，加入待測(cè)樣品。記錄260nm的OD值。設(shè)定波長(zhǎng)280nm，記錄OD值。計(jì)算樣品濃度和純度當(dāng)前第39頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶定義：能在特異位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段。

切割不同來源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。

主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。402.質(zhì)粒DNA雙酶切鑒定當(dāng)前第40頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。

限制性核酸內(nèi)切酶命名Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶當(dāng)前第41頁\共有46頁\編于星期四\12點(diǎn)

限制