發(fā)酵工程青霉素的制備

青霉素簡介

化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)

青霉素合成及調(diào)控生物合成

生物合成的調(diào)控青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

菌種發(fā)酵工藝流程培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)控制

當(dāng)前第1頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素簡介當(dāng)前第2頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素的發(fā)現(xiàn)

1929年英國學(xué)者弗萊明首先在抗生素中發(fā)現(xiàn)了青霉素，英國謝菲爾德大學(xué)病理學(xué)家弗洛里實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素的分離與純化。當(dāng)前第3頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)青霉素是含有青霉素母核的多種化合物的總稱，青霉素發(fā)酵液中至少含有5種以上的不同的青霉素：青霉素F、青霉素X、青霉素K及二氫青霉素F等。青霉素分子結(jié)構(gòu)球棍模型當(dāng)前第4頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素合成及調(diào)控當(dāng)前第5頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素的生物合成當(dāng)前第6頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素的生物合成與賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)用產(chǎn)黃霉菌生產(chǎn)青霉素要受到賴氨酸的阻遏，這是由于其賴氨酸生物合成途徑的初始酶——高檸檬酸合成酶受到了賴氨酸反饋?zhàn)瓒簟Ｔ谫嚢彼嵘锖铣赏緩街?，從氨基己二酸分支而產(chǎn)生青霉素，這種賴氨酸阻遏是初級(jí)代謝調(diào)節(jié)的效果用到次級(jí)代謝上的最好的例子。當(dāng)前第7頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素的生物合成與糖分解代謝的關(guān)系青霉素的生物合成受糖分解代謝產(chǎn)物的阻遏，如合成青霉素的?；D(zhuǎn)移酶就會(huì)被阻遏。在青霉素發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)能被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌體生長，但抑制青霉素的合成，而被緩慢利用的乳糖，卻是生產(chǎn)青霉素的最好碳源。當(dāng)前第8頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)

乳糖比葡萄糖優(yōu)越的主要原因是乳糖被水解成單糖的速度正好符合青霉素生產(chǎn)期合成青霉素的需要，而又不會(huì)產(chǎn)生高濃度的分解產(chǎn)物來抑制青霉素的合成，因此，碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原料如植物油等。但由于乳糖價(jià)格較貴，成本較高，故在生產(chǎn)實(shí)踐中常通過間隙或滴加葡萄糖的方法控制培養(yǎng)液中糖的含量，以符合菌體生長和青霉素生物合成的需要。這樣，可以降低成本，提高產(chǎn)量。當(dāng)前第9頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素生產(chǎn)發(fā)酵工藝當(dāng)前第10頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)菌種目前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。當(dāng)前第11頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素產(chǎn)生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期當(dāng)前第12頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)培養(yǎng)基碳源青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。氮源可采用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機(jī)氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機(jī)氮源。前體為生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素G，需要在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它們對(duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下。當(dāng)前第13頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素生產(chǎn)工藝過程

當(dāng)前第14頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)抗生素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗(yàn)成品包裝前體發(fā)酵階段提取階段當(dāng)前第15頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)發(fā)酵工藝流程當(dāng)前第16頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)一、總述青霉素發(fā)酵——將青霉菌接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間，得到青霉菌孢子培養(yǎng)物。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。然后將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐已滅菌的含有苯乙酸前體的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。

青霉素菌種發(fā)酵工藝的原理當(dāng)前第17頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)當(dāng)前第18頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)二、青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長并合成青霉素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。在整個(gè)過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液的PH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補(bǔ)充碳源及氮源，或補(bǔ)進(jìn)其他料液和前體等以促進(jìn)青霉素的生產(chǎn)。當(dāng)前第19頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個(gè)階段。菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時(shí)間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。青霉素合成階段：這個(gè)階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速率達(dá)到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強(qiáng)度一般無顯著變化。菌體自溶階段：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，PH上升。當(dāng)前第20頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)發(fā)酵培養(yǎng)控制加糖控制。殘?zhí)墙抵?.6%，pH上升時(shí)加糖補(bǔ)氮及加前體。補(bǔ)氮：硫酸銨、氨、尿素，使發(fā)酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前體：發(fā)酵液中殘存乙酰胺濃度為0.05%~0.08%。pH控制。6.6~6.4溫度。前期25℃

~26℃

，后期23℃

。溶解氧。不低于飽和溶解氧的30%。泡沫的控制。當(dāng)前第21頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)

基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，后期基質(zhì)濃度低，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長產(chǎn)生抑制。為了避免這一現(xiàn)象,在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法,即對(duì)容易產(chǎn)生抑制和限制作用的基質(zhì)維持一定的最適濃度。溫度：青霉素發(fā)酵的最適溫度一般認(rèn)為應(yīng)在25°C左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率,同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗,降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)前第22頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)pH值：青霉素發(fā)酵的最適pH值一般認(rèn)為在6.5左右,應(yīng)盡量避免pH值超過7.0。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定,容易加速其水解。溶氧:對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來說,溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到30%飽和度以下時(shí),青霉素產(chǎn)率急劇下降,低于10%飽和度時(shí),則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高,說明菌絲生長不良或加糖率過低,造成呼吸強(qiáng)度下降,同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。當(dāng)前第23頁\共有24頁\編于星期五\18點(diǎn)

菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。菌絲生長速度：在葡萄糖限制生長的條件下，當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比。因此,要在發(fā)酵過程中達(dá)到并維持最大比生產(chǎn)速率,必須使比生長速率不低0.015h-1。