引物選擇的過程和上群體的過程

1.2采用酚-氯仿提取法提取模板DNA1） 取固定的閉殼肌肉o.lg,在裝有ddHO的燒杯中漂洗。置于裝有670M抽提/消化液【每管加2600MSTE+60-65M10%SDS+10M蛋白酶K（+2MB巰基乙醇）】的1.5mleppendorf管中，用小剪刀剪成細(xì)末，顛倒混勻，用2B鉛筆在管蓋編號(hào)標(biāo)記,封口膜封蓋口，置水浴架上,于55°C恒溫消化至看不到固體組分方為止。然后取管，拆膜。2） 往每管中加入終濃度約20卩g/ml的RNA酶,置于水浴鍋中（55C）,關(guān)掉電源，放置30min,以去掉RNA。3） 每管中加入飽和NaCl溶液150M,1100rpm,15min后,取上清液。4） 每管加入700^等體積酚（將酚和事先配好的氯仿異戊醇等體積混合,終比為酚:氯仿：異戊醇=25:24:1）。5） 顛倒混勻10min,冷凍離心（4°C,12000rpm,10min）取上清。6） 每管加入700m氯仿異戊醇（氯仿:異戊醇=24:1），顛倒混勻5min,冷凍離心（4°C,12000rpm,10min）。圖1DNA原始濃度圖凍無水冷凍離室溫干以溶解7） 取上清液于新的管中,每管快速懸空加入2倍體積冰乙醇（一般900-950M），常溫沉淀30min圖1DNA原始濃度圖凍無水冷凍離室溫干以溶解8） 每管加入500^170%乙醇溶液,用手搖動(dòng)洗滌沉淀,心（4°C,12000rpm,10min）,棄上清。9） 將帶有DNA沉淀的eppendorf管倒置于新濾紙上，燥20min。每管加入150-200MddHO，置4°C過夜，2DNA沉淀。DNA模板的檢測:取6MddH0+1M溴酚藍(lán)+1M待測DNA模板，于1.0%瓊脂糖凝膠下電泳（電壓2120V,30min）,用掃膠儀觀察提取的DNA的分子量并根據(jù)樣品亮度和Marker亮度的對比，估計(jì)的濃度進(jìn)行稀釋的樣品。最后調(diào)整到的DNA濃度為20ng/M。1.3.2引物處理將上海生工合成的粉末狀引物，離心后，按合成單的表注量分別加入0.1倍的TE溶解,配成5uM的工作液。置于-20C冰箱保存。引物資料如表1。1.4引物的篩選1.4.1Mix-DNA瓊脂糖初篩選

圖2初篩結(jié)果圖隨機(jī)選取三亞野生貝4個(gè)個(gè)體與印度養(yǎng)殖貝4個(gè)個(gè)體。把每種貝4個(gè)個(gè)體的DNA混合成Mix-DNA作為模板用于所設(shè)計(jì)引物對的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為15卩1,其中包括20ng的基因組DNA，60pmol的引物，1XBuffer,1.5mMMgCl,0.2mMdNTPs,0.6UTaqDNA聚合酶，最后ddHO補(bǔ)至15u1圖2初篩結(jié)果圖22應(yīng)條件為94°C4min;94°C30s;60°C45s;72°C1min30s;30cycles;72°C5min;4°C保存。對于60C退火溫度下無擴(kuò)增的引物采取梯度降溫，條件依次為:57C1.5mMMgCl—55C1.5mMMgCl—50C1.5mMMgCl—50C2222.0mMMgCl.PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖下電泳檢測，挑選能夠擴(kuò)增的引物對。2如圖2所示。篩選出的引物信息表參照我前面給你們的資料1?4.2單個(gè)個(gè)體DNA瓊脂糖第二次篩選將Mix-DNA下有擴(kuò)增的引物對挑出，以上述4個(gè)三亞野生貝+4個(gè)印度養(yǎng)殖貝8個(gè)個(gè)體再次進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化。對于擴(kuò)增條帶過多引物對采取升高溫度與降低Mg2+含量的方式進(jìn)行優(yōu)化;而對于無擴(kuò)增或是擴(kuò)增不完全的引物對采取降低溫度與升高M(jìn)g2+含量的方式進(jìn)行優(yōu)化。PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖下電泳檢測,挑選出在8個(gè)體中均能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶并具有多態(tài)性的引物對。如左圖三所示。圖38個(gè)個(gè)體篩選圖1.4.3非變性聚丙烯酰胺（PAGE）第三次篩選的引物（如v）聚丙烯GoldView選取如右物的電泳錄。圖4引物篩選PAGE圖將瓊脂糖下明確有擴(kuò)增產(chǎn)物并出現(xiàn)多態(tài)性右圖三所示）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物通過12%（w/酰胺凝膠電泳的引物（如v）聚丙烯GoldView選取如右物的電泳錄。圖4引物篩選PAGE圖29%丙烯酰胺+1%亞甲雙丙烯酰胺水5XTBE10%過硫酸銨（APS）TEMED40ml39.3ml20ml0.7ml66ul表2 12%PAGE配方/100ml1.5引物在家系中的PCR擴(kuò)增與電泳

經(jīng)過三次篩選之后,我們得到59個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。選取其中的10個(gè)用于擴(kuò)增雜交家系的父母本及子代。PCR反應(yīng)條件為：94°C4min;94°C30s;退火45s;72°Clmin30s;28cycles;72°C5min;4C保存。各引物退火溫度詳見表1。反應(yīng)體系為15》1,其中包括20ngDNA,3pmo1的上游引物加3pmo1的下游引物;1XBuffer,1.5mMMgCl,0.2mMdNTPs；0.6U2TaqDNA聚合酶，最后ddHO補(bǔ)至15》l。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用12%非變性的聚丙烯酰胺電泳(PAGE)(配方如上表2),GoldView核酸染液進(jìn)行染色15min,Tanon凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照存檔。11 Marker?■4—5d0bp250bp■JlOptp圖5 引物在家系中擴(kuò)增的PAGE圖1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法為了獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)和群體的多態(tài)性變化情況，我們利用以下軟件分析：GENEPOP3.4(RaymondandRousser,1995)分析Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequi1ibrium,HWE)。用Arlequin3.01軟件統(tǒng)計(jì)觀測雜合度(observedheterozygosities,Ho)和期望雜合度(expectedheterozygosities,He);用Fstatfo