第三章高效液相色譜

第三章高效液相色譜第一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一本章內(nèi)容：高效液相色譜概述高效液相色譜儀高效液相色譜的分類高效液相色譜分析方法高效液相色譜儀的維護(hù)與保養(yǎng)高效液相色譜商品儀器及廠商第二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一一、概述概念特點(diǎn)應(yīng)用第三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一

高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)一般指采用高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏檢測(cè)器等儀器裝置，具有分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高和應(yīng)用范圍廣的一類液相色譜分析方法。第四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一高效液相色譜和經(jīng)典液相色譜的比較

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）第五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一色譜柱流動(dòng)相的推動(dòng)力檢測(cè)方式

粗粒多孔固定相，大口徑、長玻璃柱管全多孔微粒固定相，小口徑，短不銹鋼柱管

HPLC依靠重力讓溶劑流下，分離速度慢，分析時(shí)間長(1～20h)

采用高壓泵輸送流動(dòng)相，可準(zhǔn)確控制流速，分析速度快(0.05～1h)HPLC用于混合物的分離，一般分離和檢測(cè)過程獨(dú)自將柱分離技術(shù)與光學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用，使得液相色譜從最初的以分離目的為主，發(fā)展為可以同時(shí)完成分離分析

HPLC

第六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一高效液相色譜適用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和天然產(chǎn)物；合成和高分子化合物，以及無機(jī)和有機(jī)離子型化合物。在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)，核堿、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物質(zhì)的純化和分析。藥物分析

合成藥物的純化及質(zhì)量控制，中草藥有效成分的分離、制備及純度測(cè)定以及臨床醫(yī)學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)研究中的分離分析。除聚合物外,約80%的藥物都能用高效液相色譜進(jìn)行分離和純化。特別是手性藥物的分離分析。第七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一高效液相色譜法測(cè)定野蕨菜氨基酸成分

第八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一

色譜條件：ShimpackCLCCN色譜柱，(150mm×6.0mm,5μm)，流動(dòng)相：正己烷-乙醇-甲醇(87.8∶10.2∶2,V/V/V)；流速1.10mL·min-1；檢測(cè)波長240nm；柱溫40℃。

同時(shí)測(cè)定人血漿中地西泮、硝西泮、氯硝西泮、咪達(dá)唑侖、三唑侖、艾司唑侖和阿普唑侖7種藥物的濃度第九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一磺酸酯在HPLC上的手性分離第十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一食品分析

①食品本身組成,特別是營養(yǎng)成分，如糖、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、合成色素、甜味劑和保鮮化學(xué)物質(zhì)的分析；③食品污染物，如農(nóng)藥殘余和黃曲霉素等的分析第十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一同時(shí)測(cè)定鰻魚中磺胺嘧啶（ＳＤ）、磺胺甲基嘧啶（ＳＭ１）、磺胺二甲嘧啶（ＳＭ２）、磺胺甲氧嗪（ＳＭＰ）、磺胺甲噁唑（ＳＭＺ）、磺胺間甲氧嘧啶（ＳＭＲ）、磺胺間二甲氧嘧啶（ＳＤＭ）、磺胺喹噁啉（ＳＱＸ）8種磺胺類藥物第十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一環(huán)境監(jiān)測(cè)

該法特別使用于分子量大,揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)污染物的分離和分析。如多環(huán)芳烴、酚類、多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸酯類、聯(lián)苯胺類、陰離子和非離子表面活性劑、有機(jī)農(nóng)藥等。第十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一圖1十六種PAH標(biāo)樣的HPLC紫外譜圖圖2十六種PAH標(biāo)樣的HPLC熒光譜圖以標(biāo)準(zhǔn)譜圖相對(duì)照。圖1和圖2為十六種PAH標(biāo)樣在ZorbaxODS柱的HPLC圖，出峰順序?yàn)?.萘，2.苊烯，3.苊十芴，4.菲，5.蒽，6.熒蒽，7.芘，8.苯并(a)蒽十枹，9.苯并(b)熒蒽，10.苯并(k)熒蒽，11.苯并(a)芘，12.二苯并(a，h)蒽，13.苯并(ghi)苝，14.茚并(1,2,3-cd)芘。水質(zhì):多環(huán)芳烴的測(cè)定第十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一精細(xì)化工產(chǎn)品分析

具有較高分子量和較高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，如高碳數(shù)脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等化工產(chǎn)品

制備分離應(yīng)用

在許多科學(xué)研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，往往需要制備或提取一些高純化合物。

第十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一色譜過程是一特殊的動(dòng)態(tài)多次重復(fù)分離過程：從進(jìn)樣閥引入的樣品組分被流動(dòng)相帶入色譜柱。由于不同組分與流動(dòng)相和固定相的分子間作用力不同，它們?cè)谏V柱的移動(dòng)速度不同，先后流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器。由檢測(cè)器記錄分離過程--色譜圖。1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置第二十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一在線脫氣機(jī)色譜泵及控制器進(jìn)樣器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理及控制色譜柱第二十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一流動(dòng)相脫氣裝置目的：使色譜泵的輸液準(zhǔn)確—脈動(dòng)減少；保留時(shí)間及色譜峰面積重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)性能—防止氣泡引起的尖峰；基線穩(wěn)定保護(hù)色譜柱—減少死體積；防止填料的氧化惰性氣體脫氣法：向溶劑中吹入氦氣等小分子氣體，以使溶解在流動(dòng)相中的空氣等氣體脫出。超聲波脫氣法：將溶劑瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣，一般500mL流動(dòng)相超聲20～30min。此法方便，不影響流動(dòng)相的組成，適用于各種流動(dòng)相脫氣。抽真空：溶劑抽濾在線脫氣：可保持連續(xù)脫氣。第二十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：第二十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一高壓輸液系統(tǒng)：一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。要求：泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。能在高壓下連續(xù)工作。通常要求耐壓40～50MPa·cm-2。輸出流量范圍寬。一般為0.1～10mL/min。輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高。流量控制的精密度應(yīng)小于1%第二十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一高壓泵要求：泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。能在高壓下連續(xù)工作。通常要求耐壓40～50MPa·cm-2。

輸出流量范圍寬。一般為0.1～10mL/min。輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高。流量控制的精密度應(yīng)小于1%（動(dòng)畫1）第二十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵）

第二十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一梯度洗脫梯度洗脫指采用兩種（或多種）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)變化流動(dòng)相組成比和極性的一種洗脫模式。對(duì)于復(fù)雜混合物，特別是保留性能相差較大的混合物的分離梯度洗脫是一種極為重要的手段。特點(diǎn)（1）改善分離,加快分析速度；

（2）改善峰形,減少拖尾,

有利于痕量組分的檢測(cè)

第二十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一梯度洗脫第二十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一進(jìn)樣系統(tǒng)：不使整個(gè)壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱高效液相色譜儀采用閥進(jìn)樣方式。分手動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)進(jìn)樣

1）液相色譜進(jìn)樣針：平頭，25、50和100μl等

2）閥進(jìn)樣（環(huán)路進(jìn)樣器）

進(jìn)樣量大小通過選擇不同體積（1～100μl）的定量管決定。當(dāng)進(jìn)樣閥手柄置于“取樣（load）”位置時(shí)，用特制的平頭注射器將樣品液注入取樣管。再將進(jìn)樣閥手柄轉(zhuǎn)向“進(jìn)樣（inject）”位置時(shí)，流動(dòng)相將樣品掖攜帶進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離。3）自動(dòng)進(jìn)樣器在程序控制器或計(jì)算機(jī)控制下可自動(dòng)完成取樣、進(jìn)樣、清洗等一系列操作，一次可進(jìn)行幾十個(gè)或上百個(gè)樣品的分析。第二十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一（動(dòng)畫2）第三十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一自動(dòng)進(jìn)樣裝置第三十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一分離系統(tǒng)：色譜柱

包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。

操作注意：流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換流速的變化幅度溫度變化幅度專用色譜柱：樣品及溶劑的要求有機(jī)——有機(jī)溶劑：直接轉(zhuǎn)換有機(jī)——緩沖溶液：用純水過渡記住：拿到一根新柱一定要先看使用說明第三十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一檢測(cè)器：利用被測(cè)物的某一物理或化學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異的原理，當(dāng)被測(cè)物從色譜柱上流出時(shí)，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相背景值發(fā)生變化，從而在色譜圖上以色譜峰形式表現(xiàn)出來。

幾種主要檢測(cè)器的基本特性第三十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一紫外吸收檢測(cè)器（UV-VIS）

具有靈敏度高，線性范圍寬，對(duì)流動(dòng)相基本無響應(yīng)，對(duì)流速和溫度不敏感等特點(diǎn)，它是液相色譜最常用的檢測(cè)器。固定波長型：光源波長固定，一般為254nm，簡單、靈敏?？勺儾ㄩL型：常規(guī)氘燈（紫外光源）的使用范圍195～400nm掃描型或二極管陣列：可以瞬間實(shí)現(xiàn)紫外可見光區(qū)的全波長掃描，得到時(shí)間－波長－吸收強(qiáng)度三維色譜圖。樣品池第三十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一紫外光度檢測(cè)器光路圖：（動(dòng)畫3）第三十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一

紫外檢測(cè)的主要參數(shù)是選擇檢測(cè)波長

應(yīng)考慮溶質(zhì)和流動(dòng)相的吸收特性：常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測(cè)波長，但為了選擇性或其他目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長；應(yīng)盡可能選擇檢測(cè)波長下沒有背景吸收的流動(dòng)相第三十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第三十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第三十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一示差折光檢測(cè)器（refractiveindex，RX）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器。通過連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)定溶質(zhì)濃度。折射率是物質(zhì)的通用性質(zhì)，示差折射檢測(cè)器是一種通用型的整體性質(zhì)檢測(cè)器折射率對(duì)溫度的變化非常靈敏，檢測(cè)器必須恒溫靈敏度較低，不能用于梯度洗脫。第三十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector，F(xiàn)LD）它用于檢測(cè)物質(zhì)本身具有熒光或?yàn)榱颂岣哽`敏度將無熒光的物質(zhì)衍生成熒光體。可用熒光檢測(cè)的物質(zhì)：如某些代謝物、食品、藥物、氨基酸、多肽、胺類、維生素、石油高沸點(diǎn)餾分、生物堿和甾族化合物等熒光檢測(cè)器是一種很靈敏的,有選擇性的檢測(cè)器,其靈敏度比UV高10~1000倍,一般可測(cè)ppb級(jí)的化合物第四十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第四十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemicaldetector，ECD）對(duì)于具有電活性的物質(zhì),在液相色譜中可采用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)。它包括電導(dǎo)庫侖、安培、極譜、電位和光電導(dǎo)等形式；具有高選擇性、高靈敏度、低造價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。第四十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一聯(lián)用檢測(cè)器液相色譜儀與質(zhì)譜聯(lián)用與紅外光譜儀聯(lián)用與核磁共振聯(lián)用與原子吸收、原子發(fā)射光譜儀聯(lián)用等

第四十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一工作站所有分析過程都可在線模擬顯示，數(shù)據(jù)自動(dòng)采集、處理和存儲(chǔ)，并對(duì)整個(gè)分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制。

Millennium32處理軟件第四十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一一、按分離過程的物理化學(xué)原理分類

吸附色譜(AdsorptionChromatography)分配色譜（PartitionChromatography）離子交換色譜（IonExchangerChromatography）空間排阻色譜（SizeExclusionChromatography）親合色譜（AffinityChromatography）二、按實(shí)際應(yīng)用色譜類型分類

正相色譜與反相色譜離子對(duì)色譜離子交換色譜和離子色譜空間排阻色譜手性色譜電色譜等三、分離類型的選擇第四十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一吸附色譜(AdsorptionChromatography)用固體吸附劑作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，樣品中各組分依據(jù)它們?cè)谖絼┥衔搅Φ拇笮磉M(jìn)行分離的色譜方法

流動(dòng)相

活性吸附點(diǎn)

固定相

液固吸附色譜第四十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一分配色譜（PartitionChromatography）

用載帶在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，樣品中各組分依據(jù)它們?cè)诠潭ㄒ褐腥芙饽芰Υ笮?，即在固定相和流?dòng)相間的分配系數(shù)大小來進(jìn)行分離的色譜方法。

液液分配色譜

第四十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一離子交換色譜

（IonExchangerChromatography）用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，樣品中各離子組分依據(jù)它們與離子交換劑上荷電交換基團(tuán)的交換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。

離子交換色譜

第四十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一空間排阻色譜（SizeExclusionChromatography）

用化學(xué)惰性多孔物質(zhì)作固定相，樣品中各組分依據(jù)它們?cè)诹鲃?dòng)相的分子體積大小來進(jìn)行分離的色譜方法。以水溶液作流動(dòng)相的排阻色譜稱為凝膠過濾色譜（GelFitrationChromatography）；以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的排阻色譜稱為凝膠滲透色譜（GelPermeationChromatography）。

排阻色譜第五十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一親合色譜（AffinityChromatography）

用固相基體上固載化生物特異性吸附的配位體作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，樣品中各生物活性分子組分依據(jù)它們與固相基體上固載的配位體之間的特異親合力大小來進(jìn)行分離的色譜方法

親合色譜第五十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一正相色譜與反相色譜

正相色譜（NormalPhaseChromatography）

固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物

。依據(jù)溶質(zhì)分子的極性大小進(jìn)行分離。溶質(zhì)分子與固定相的極性基團(tuán)產(chǎn)生特異的極性相互作用，極性作用大小決定的保留時(shí)間大小

反相色譜（ReversedPhaseChromatography）

固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適于分離非極性、極性或離子型化合物，應(yīng)用范圍比正相廣（約80％分析任務(wù)）。依據(jù)溶質(zhì)分子的疏水性大小進(jìn)行分離。溶質(zhì)分子疏水基與疏水固定相產(chǎn)生非特異的疏水相互作用，疏水作用大小決定的保留時(shí)間大小。反相色譜中常用含水乙腈、甲醇和四氫呋喃的流動(dòng)相。第五十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一離子對(duì)色譜

離子抑制技術(shù)

降低流動(dòng)相的酸度，離解增大，造成保留降低；增大流動(dòng)相的酸度，抑制弱酸離解，保留時(shí)間增大。調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH大小，抑制離子離解，可使弱酸或弱堿的有機(jī)物在反相柱上得到較好的保留反相離子對(duì)色譜流動(dòng)相添加"離子對(duì)試劑"，使得難保留的樣品離子與離子對(duì)試劑形成中性離子對(duì)締合物，增加它們?cè)诜聪嘀系谋Ａ裟芰?。不同的樣品離子,形成離子對(duì)的能力不同，導(dǎo)致它們?cè)谏V柱的保留時(shí)間不同。大多數(shù)可離解的化合物在液固色譜分離時(shí)，強(qiáng)烈的吸附在硅醇基上,造成保留時(shí)間太大,甚至不能流出色譜柱,或者嚴(yán)重拖尾,柱效很低。同樣，離子型化合物在反相色譜中也難于保留。采用離子抑制技術(shù)或離子對(duì)色譜方法可對(duì)它們進(jìn)行分離分析。通常應(yīng)用于酸和堿混合物的分離及金屬螯合物的分離。第五十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一離子色譜離子交換色譜離子交換色譜是一種以離子交換劑為固定相，用來分離分析陽離子和陰離子的液相色譜法，其分離原理是溶質(zhì)離子和流動(dòng)相中的抗衡離子間與離子交換劑上的固定離子點(diǎn)位的親合競爭。

凡是在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都能用離子交換色譜進(jìn)行分離，它不僅適用于無機(jī)離子混合物的分離，也可用于有機(jī)物的分離，特別是氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的分析。一般采用含鹽的水溶液作流動(dòng)相，流動(dòng)相選擇應(yīng)滿足：能夠溶解各種鹽并提供離子交換必需的緩沖液具有合適的離子強(qiáng)度以便控制樣品離子的保留值對(duì)被分離的對(duì)象有選擇性第五十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一

空間排阻色譜

(SizeExclusionChromatography,SEC)根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效體積、流體力學(xué)體積)的差別進(jìn)行分離的。排阻色譜的應(yīng)用范圍廣泛，特別是在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域,可用于分離那些因溶解度、極性吸附或離子特性無足夠差異的,分子量在10~106這樣一個(gè)寬范圍的大分子混合物排阻色譜（凝膠色譜）：凝膠滲透色譜(GPC)：以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相凝膠過濾色譜(GFC)：以水為流動(dòng)相的凝膠色譜第五十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一手性色譜手性化合物在生命科學(xué)中占有十分重要的位置，特別是在生物化學(xué)，藥物化學(xué)等領(lǐng)域中尤為突出，醫(yī)藥工業(yè)中約有30%～40%藥物是具有手性的。手性色譜是分離分析手性化合物的重要方法。第五十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一毛細(xì)管電色譜

(CapillaryElectrochromatography,CEC)

毛細(xì)管電色譜通常指以電滲流代替壓力流推動(dòng)流動(dòng)相的毛細(xì)管柱高效液相色譜。毛細(xì)管電色譜一般采用熔融的50~100μm的石英毛細(xì)管柱，柱內(nèi)填充1~3μm

的HPLC固定相，在毛細(xì)管電泳儀實(shí)現(xiàn)分離檢測(cè)。第五十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一親合色譜

AffinityChromatography親合色譜指用固相基體上固載化生物特異性吸附的配位體作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，樣品中各生物活性分子組分依據(jù)它們與固相基體上固載的配位體之間的特異親合力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。第五十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一分離類型的選擇根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是200～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。根據(jù)溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度。如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳。如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。第五十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。

現(xiàn)列出下表作為選擇分離類型的參考。第六十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一液相色譜分離類型選擇參考表

溶于水——排阻色譜，水為流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量＞2000

不溶于水——排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對(duì)分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000

排阻色譜，水為流動(dòng)相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對(duì)色譜第六十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第六十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一HPLC分析方法建立的一般過程HPLC定性、定量分析HPLC基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)第六十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一首先要查文獻(xiàn)資料,包括儀器廠商的應(yīng)用資料,了解他人的工作,找出你需要的參考條件。若手頭沒有合適的參考資料,則可根據(jù)分子分子量大小、在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)確定分離模式,選擇主要的色譜條件：色譜柱、流動(dòng)相組成和檢測(cè)器類型。評(píng)價(jià)液相色譜柱系統(tǒng)選擇的二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：

①有滿意的分離度

②有合適的保留值范圍。第六十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一定性分析利用保留值定性

對(duì)照保留值：在確定的色譜條件下(色譜柱、流動(dòng)相組成、柱溫等),對(duì)照被測(cè)化合物與標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)加入：對(duì)照樣品和加標(biāo)樣品的峰高變化確定被測(cè)化合物的色譜峰位置利用檢測(cè)器的選擇性定性（聯(lián)用技術(shù)）

采用全波長掃描吸收檢測(cè)器：對(duì)照被測(cè)化合物與標(biāo)準(zhǔn)物的保留值和光譜圖。

采用質(zhì)譜檢測(cè)器：對(duì)照被測(cè)化合物與標(biāo)準(zhǔn)物的保留值和質(zhì)譜圖。離線結(jié)構(gòu)分析：收集柱后流出的純組分，進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析

第六十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第六十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第六十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第六十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第七十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第八十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一二.噪音N,漂移M,檢測(cè)限D(zhuǎn)是否靈敏度放大到越高越好?檢測(cè)限D(zhuǎn)(也叫敏感度)定義:為檢測(cè)器二倍噪聲的水平

噪音N,漂移M

D=2N/SS↑N↓D越小越敏感因此性能好的Det,不但靈敏度高而且噪聲要小組分在Det中的信號(hào)必須大于Det本底信號(hào)(噪聲)才能與噪聲區(qū)別，規(guī)定:組分信號(hào)至少為噪聲的二倍,才可定量。第八十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一三.最小檢測(cè)量mminmmin定義:產(chǎn)生色譜峰高等于二倍噪聲(2N)時(shí)的進(jìn)樣量

∵進(jìn)樣量為m時(shí),洗出峰高為h,記錄儀靈敏度u1m:hu1=mmin:2N∴mmin=mN/hu1=mDSc/hu1

∵Sc=u1FdA/u2mA=1.065*W1/2*h(1)對(duì)濃度型Detmmin=(1.065Fd/u2)*W1/2*D(2)對(duì)質(zhì)量型Detmmin=(1.065*60/u2)*W1/2*D第八十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一四.最小檢測(cè)濃度指一定進(jìn)樣量m時(shí),GC分析所能檢測(cè)出的最低濃度Cmin=mmin/

V

mg/LV--進(jìn)樣體積五.線形范圍R∝C

定義:信號(hào)與進(jìn)樣量成正比的數(shù)量范圍即最大允許進(jìn)樣量與最小允許進(jìn)樣量之比線形范圍寬:

表示不管是含量高的組分或是微量組分都能準(zhǔn)確定量第八十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一樣品制備樣品的溶解

用于溶解分析樣品的溶劑應(yīng)與液相色譜流動(dòng)相互溶，最好選用流動(dòng)相來溶解或提取被分析樣品的待測(cè)組分，這樣可以避免溶劑峰的干擾。

制備好的分析試液應(yīng)為均相溶液，無不溶物，否則在進(jìn)行色譜分析之前應(yīng)進(jìn)行0.45μm或0.2μm微孔膜過濾。目的是使樣品與所使用的HPLC方法相兼容，即把分析樣品中的待測(cè)組分轉(zhuǎn)化為適合HPLC直接進(jìn)樣分析的試液。第九十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一樣品前處理

a.過濾和離心：對(duì)于基體復(fù)雜的樣品液，不溶物可以通過過濾或高速離心除去。有時(shí)加入合適沉淀劑或改變?nèi)軇勾蠓肿踊|(zhì)以沉淀方式除去。

b.液液萃?。核畼又械拇郎y(cè)有機(jī)化合物通過液液萃取到有機(jī)相后進(jìn)行液相色譜分析

c.固相萃取（SolidPhaseExtraction,SPE）：利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜分離原理，使液體樣品通過一吸附劑小柱，保留其中某些組分，再選用適當(dāng)?shù)娜軇_洗雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。

第九十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一流動(dòng)相的配制配制：對(duì)于二元溶劑或多元溶劑等度洗脫，液相色譜流動(dòng)相通常均按溶劑體積比配制。要求溶劑必須互溶過濾：HPLC流動(dòng)相使用前要用0.45m微孔膜過濾

溶于流動(dòng)相的空氣會(huì)影響液相色譜系統(tǒng)的操作性能。如氣泡進(jìn)入泵腔將使高壓泵流速不穩(wěn)；而流動(dòng)相通過柱子時(shí)其中的氣泡受到壓力而壓縮，流出柱子到檢測(cè)器時(shí)，會(huì)因?yàn)閴毫抵脸憾鴮馀葆尫懦鰜?，造成檢測(cè)器噪聲增大，基線不穩(wěn)。第九十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第九十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第九十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一第九十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一Waters

600E型HPLC操作規(guī)程

一.沖洗流路1.開脫氣機(jī)電源,開泵控制器電源。2.按“Setup”功能鍵,設(shè)定壓力范圍。3.按“Direct”,鍵,設(shè)定流速和溶劑組成。4.開清洗閥,從多通閥抽出殘余的溶劑。5.降流速,關(guān)清洗閥,升流速,平衡色譜系統(tǒng)二.系統(tǒng)配置1.開檢測(cè)器電源。開微機(jī)電源。2.雙擊Millennium圖標(biāo),進(jìn)入軟件。3.雙擊Configure

system圖標(biāo),擊Acquisition、0K。擊Acquisition

severs的“+”號(hào),擊儀器系統(tǒng)名。4.擊File菜單,選Exit。5.雙擊Browse

Project圖標(biāo),選合適的項(xiàng)目名、0K。6.擊QuickSet工具。第九十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一三.設(shè)置儀器方法1.擊Instrument

Method中的Edit按鈕。2.在Instruments樹下,擊600泵,輸入壓力上下限,再輸入流速和溶劑比例。3.在Instruments樹下,擊2487檢測(cè)器,設(shè)置起止波長4.選Fi1e、Save

as,輸入儀器方法名,擊Save按鈕。5.選File、Exit。

6.在QuickSet的儀器方法下的下拉菜單中選一個(gè)儀器方法7.擊Monitor,觀察基線情況。

第九十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一四.運(yùn)行色譜1.擊Run工具,準(zhǔn)確抽取標(biāo)樣或樣品。2.將進(jìn)樣針插入進(jìn)樣孔,將進(jìn)樣閥柄向上扳到Load位置3.注入溶液,再將閥柄向下扳到Iniect位置,拔出進(jìn)樣針。五.色譜數(shù)據(jù)處理1.一次運(yùn)行結(jié)束后,在Project的Channel中擊待處理樣品名2.擊Review工具,在3D下切取某波長的色譜。3.擊處理方法向?qū)А?.設(shè)置峰寬、臨界值、積分區(qū)間、最小峰面積(或峰高)5.輸入組分名稱和濃度。6.擊積分工具。7.選File、Save、Resuit。

第九十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期一六.打印色譜報(bào)告1.在Proiect中選Results標(biāo)簽,再選其中的樣品名。2.擊預(yù)覽工具