核酸分子雜交演示文稿

核酸分子雜交演示文稿1當(dāng)前第1頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)核酸分子雜交當(dāng)前第2頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)3（一）“戴帽安尾（穿靴）”（核內(nèi)）——5加帽和多聚腺苷酸化及其調(diào)控意義

1.mRNAcaping→5’加上GpppmNP帽子，tailing→加上AA···（50~200bp）尾巴。

意義（1）保護(hù)作用—保護(hù)mRNA免受核酸酶降解，（2）標(biāo)識(shí)作用—為翻譯提供識(shí)別位點(diǎn)（CBP）。

2.rRNA不易被降解的機(jī)理可能是因?yàn)槠浣M成核糖體是在核內(nèi)組裝的。

3.tRNA合成后形成特殊的空間結(jié)構(gòu)（三葉草，倒L），可能抵抗降解，半壽期長(zhǎng)。當(dāng)前第3頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)4當(dāng)前第4頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)5hnRNA內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的堿基順序具有最強(qiáng)的保守性

5'GT——AG3'當(dāng)前第5頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)6（二）mRNA的選擇剪接對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用

1.mRNA的選擇剪接有多種方式選擇剪接方式要點(diǎn)（1）外顯子選擇Optionexon或稱外顯子跳躍（exonskipping）→全部保留或至少刪除1個(gè)或幾個(gè)外顯子。（2）內(nèi)含子選擇Optionintron→內(nèi)含子全部刪除保留1個(gè)（近來也有內(nèi)含子表達(dá)的報(bào)道）。（3）互斥外顯子Mutuallyexclusiveexon→2個(gè)外顯互斥→在同1個(gè)成熟mRNA只出現(xiàn)1個(gè)。（4）內(nèi)部剪接位點(diǎn)Internalsplicesite→通過剪接供點(diǎn)或受點(diǎn)選擇決定選擇或剪切。m7Gpppm7GpppintronexonexonAAA···AAA···P259當(dāng)前第6頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)7當(dāng)前第7頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)82.可變剪接的調(diào)控機(jī)制⑴SR蛋白家族的調(diào)控剪接體的形成與多種蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合體密切相關(guān)。在可變剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的參與起重要作用。SR蛋白家族以不同的質(zhì)的組成與量的差異選擇特定的mRNA前體剪接位點(diǎn)，不同的SR家族蛋白對(duì)適當(dāng)?shù)膍RNA前體可以誘導(dǎo)出不同選擇的剪接方式，在選擇剪接上起決定作用。當(dāng)前第8頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)9⑵RNP的調(diào)節(jié)hnRNP-A1在不同組織中的含量變化很大，不參與組成性剪接。在選擇5’和3’剪接點(diǎn)時(shí)具有可變剪接活性，成為參與可變剪接的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)與SR蛋白共同調(diào)節(jié)組織特異性的剪接。U5hnRNP在酵母中參與5’剪接點(diǎn)突變的可變剪接。當(dāng)前第9頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)10⑶

外顯子限定模型真核細(xì)胞mRNA前體中內(nèi)含子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子，5’與3’剪接位點(diǎn)可以跨越數(shù)萬個(gè)核苷酸準(zhǔn)確地組合在剪接體中。有證據(jù)表明，在前速激肽原mRNA前體的可變剪接中，外顯子下游的5’剪接位點(diǎn)可影響其上游內(nèi)含子3’的剪接。當(dāng)前第10頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)11選擇剪接對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用（實(shí)例）（1）Bax基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇剪接

Bax基因編碼產(chǎn)物是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的分子，（Bax/Bcl2↑調(diào)亡↑）

Bax編碼產(chǎn)生的Pr.有幾種（α、β、γ等），結(jié)構(gòu)略有差異，差異的產(chǎn)生來自mRNA的選擇性剪接。①Baxα→保留全部（6個(gè)）外顯子→共192個(gè)密碼子→譯出192AA多肽②Baxβ→保留全部外顯子和第5個(gè)內(nèi)含子（含終止碼）→共218個(gè)密碼子。③Baxγ→保留1、3、4、5、6外顯子，刪除第2個(gè)外顯子→譯出151AA多肽。當(dāng)前第11頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)12（2）選擇剪接產(chǎn)生的IκBr①NF-κB是非廣泛存在的方式作用因子→可與基因上游啟動(dòng)子元件或增加子內(nèi)部的κB元件結(jié)合而→調(diào)節(jié)基因表達(dá)。②NF-κB與IκBr結(jié)合時(shí)→以無活性NFκB/IκBr復(fù)合體（105KD）→存在于胞漿③IκBr基因表達(dá)時(shí)→通過選擇剪接→刪除其mRNA中的178個(gè)或67個(gè)密碼子→閱讀框移動(dòng)→產(chǎn)生2種具有新C端Pr.異構(gòu)體→即IκBr1和IκBr2→2者缺失了1個(gè)蛋白激酶A位→該位點(diǎn)磷酸化調(diào)節(jié)IκBr活性。④剪接產(chǎn)生IκBr異構(gòu)體→有可能使NF-κB對(duì)胞內(nèi)作出不同響應(yīng)，尚在研究中。當(dāng)前第12頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)13當(dāng)前第13頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)14（三）RNA編輯RNA編輯（RNAediting）是在RNA分子上出現(xiàn)的一種修飾現(xiàn)象。主要指mRNA在轉(zhuǎn)錄后因插入、缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)。RNA編輯似乎是中心法則的例外。編輯擴(kuò)大了遺傳信息，也可能是生物適應(yīng)的一種保護(hù)措施。P260當(dāng)前第14頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)151.核苷酸的替換⑴

Ｃ→U替換最典型的例子是載脂蛋白B的RNA編輯。Ｃ→U替換使Apo-B100CAA編碼的谷氨酰胺突變?yōu)閁AA的終止密碼子，產(chǎn)生編碼Apo-B48的mRNA。在蛋白質(zhì)水平上只保留了Apo-B100分子N端脂蛋白裝配結(jié)構(gòu)域，缺少了C端低密度脂蛋白受體結(jié)合區(qū)。當(dāng)前第15頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)16當(dāng)前第16頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)17⑵

A→I替換在β珠蛋白、c-Myc、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因中都有因A→I替換使互補(bǔ)鏈的U被RNA酶A水解的現(xiàn)象。當(dāng)前第17頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)182.可讀框的改變可讀框的改變主要是核苷酸的插入或缺失。G或C的插入則往往是因?yàn)槟０迳线B續(xù)幾個(gè)C（或G）之后，互補(bǔ)鏈因一種滑動(dòng)力而被添加到RNA中。當(dāng)前第18頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)19當(dāng)前第19頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)20當(dāng)前第20頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)213.向?qū)NA向?qū)NA（gRNA）是一種線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的短RNA（約55～70核苷酸），能以正常堿基配對(duì)或GU配對(duì)的方式，選擇其5’末端“錨區(qū)”在mRNA上的互補(bǔ)序列，為隨后插入或缺失U提供模板。當(dāng)前第21頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)22當(dāng)前第22頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)23當(dāng)前第23頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)24（四）mRNA運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控→mRNA運(yùn)輸是受控制的。1.3H-udR顯示約20%mRNA→胞漿，核內(nèi)RNA約在1小時(shí)內(nèi)降解成→小片段2.核孔9nm，但可運(yùn)輸>9nm顆粒（如核糖體15nm，在核內(nèi)組裝→入胞作用）

用20nm金顆粒（goldsphere）包裝小RNA（如tRNA或5sRNA）→注射到蛙卵（frogoocyte）→可迅速過核孔到→胞漿。但注射入漿→則不能入核說明mRNA主動(dòng)運(yùn)輸入胞，但機(jī)制不清楚。P261當(dāng)前第24頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)25翻譯起始的調(diào)控未受精卵：隱蔽mRNA(maskedmRNA)；受精：招募因子(recruitmentfactor)，激活隱蔽mRNA阻遏蛋白的調(diào)控：鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryiron-bindingprotein)翻譯起始因子的調(diào)控：eIF-2，血紅素對(duì)珠蛋白合成的調(diào)節(jié)5′AUG對(duì)翻譯的調(diào)控作用：減少正常AUG啟動(dòng)翻譯的作用，使翻譯維持在較低水平mRNA5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度對(duì)翻譯的影響翻譯水平的調(diào)控當(dāng)前第25頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)26翻譯水平的調(diào)控原核生物mRNA的半衰期很短，在翻譯水平上的調(diào)控對(duì)于基因表達(dá)的影響也很小。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)控制著翻譯的起始，核糖體蛋白的自體控制對(duì)蛋白質(zhì)的合成起抑制作用。真核生物mRNA的半衰期比原核生物長(zhǎng)的多，因此翻譯過程受調(diào)控的機(jī)會(huì)也較多。當(dāng)前第26頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)27翻譯水平的調(diào)控是真核生物基因表達(dá)多級(jí)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。真核生物翻譯水平調(diào)控最普遍的機(jī)制是起始因子的磷酸化。蛋白質(zhì)合成裝置各元件裝配活力的改變是導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯速率變化的主要因素。翻譯的速度和細(xì)胞生長(zhǎng)的速度是密切協(xié)調(diào)的。當(dāng)前第27頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)28一、翻譯因子磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)合成因子的磷酸化狀態(tài)與其對(duì)蛋白質(zhì)生物合成的激活或抑制作用密切相關(guān)。1．eIF-4F通過亞單位的可逆磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)生物合成進(jìn)行調(diào)控。eIF-4E(α)和eIF-4G(γ/P220)亞基的磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)的生物合成有激活作用。當(dāng)前第28頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)29當(dāng)前第29頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)302．其他因子磷酸化對(duì)翻譯的激活作用eIF-4B在促有絲分裂劑作用下，隨eIF-4F和核糖體蛋白S6一起，在細(xì)胞內(nèi)被磷酸化，激活起始因子eIF-4A和eIf-4B的活性。3．eIF-2的磷酸化對(duì)翻譯的抑制作用eIF-2α亞基的磷酸化會(huì)導(dǎo)致eIF-2與eIF-2B緊密結(jié)合，直接影響了eIF-2的再利用，引起翻譯起始作用受阻，從而抑制蛋白質(zhì)的生物合成。當(dāng)前第30頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)31阻遏Pr.的調(diào)控作用進(jìn)入胞漿并非所有的mRNA分子→立即與核糖體結(jié)合→翻譯成Pr.

一些特定的翻譯抑制Pr.→可結(jié)合到mRNA5’,抑制翻譯。如：鐵Pr.（ferritin）mRNA5’端非編碼區(qū)約30個(gè)核甘酸序列稱為鐵反應(yīng)元件（iron-responseelement）→可折疊成1個(gè)莖環(huán)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）→可結(jié)合1個(gè)鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白（regulatoryiron-bindingpro）。當(dāng)前第31頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)323′3′（1）有鐵→不抑制，快譯運(yùn)輸工具。（2）無鐵結(jié)合可運(yùn)→鐵結(jié)合Pr.結(jié)合mRNA→抑制翻譯。鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白當(dāng)前第32頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)33Met40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6①elF-3②ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B，PAB③MetMet-tRNAiMet—elF-2—GTP真核生物肽鏈合成起始過程60S40SMetGDP+Pi各種elF釋放elF-5④Met80S起始復(fù)合物當(dāng)前第33頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)34當(dāng)前第34頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)35當(dāng)前第35頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)36翻譯起始因子(eIF2)的調(diào)控當(dāng)前第36頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)37(2)翻譯起始因子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的速度無活性的elF-2

elF-2有活性的elF-2P

P

PPP當(dāng)前第37頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)385’-AuG對(duì)翻譯的調(diào)控作用（1）按Pr.生物合成模型，90%真核mRNA符合第1AUG規(guī)律→譯出正常Pr.（2）5’AUG可以減少正常AUG翻譯起始作用→使翻譯維持在較低水平。原癌基因中是控制原癌基因表達(dá)的重要因素→缺失→導(dǎo)致某些原癌基因翻譯激活。5’-AUG(1個(gè)或數(shù)個(gè))第1-AUG非編碼區(qū)非正常開放閱讀框編碼區(qū)正常開放閱讀框5’3’mRNA當(dāng)前第38頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)39mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)3′端非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)影響其穩(wěn)定性：3′端富含A和U的結(jié)構(gòu)，引起mRNA不穩(wěn)定蠶蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蠶絲蛋白，mRNA半衰期達(dá)100小時(shí)，其他僅2.5小時(shí)翻譯水平的調(diào)控當(dāng)前第39頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)40mRNA降解的機(jī)制當(dāng)前第40頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)41小分子RNA（lin-4）對(duì)翻譯水平影響Lin-14核Pr.調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間選擇Lin-4產(chǎn)生2個(gè)小分子RNA：1個(gè)長(zhǎng)度22個(gè)核苷酸，另1個(gè)在3’端延長(zhǎng)至40個(gè)核苷酸Lin-4RNA結(jié)合→Lin14mRNA3’UTR中的特異順序→去掉這種順序→mRNA就不會(huì)被抑制翻譯。小分子RNA對(duì)翻譯水平的影響當(dāng)前第41頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)42新生肽鏈的水解：酶解肽鏈N端的第一個(gè)氨基酸：穩(wěn)定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）與去穩(wěn)定氨基酸肽鏈中氨基酸的共價(jià)修飾：磷酸化、甲基化、?；ㄟ^信號(hào)肽(signalpeptide)分揀、運(yùn)輸、定位翻譯后水平的調(diào)控當(dāng)前第42頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)43蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送（proteintargeting）

蛋白質(zhì)合成后的去向留在胞漿進(jìn)入核、線粒體或其它細(xì)胞器分泌至體液，輸送至靶器官靶向輸送--蛋白質(zhì)合成后，定向地到達(dá)其執(zhí)行功能的目標(biāo)地點(diǎn)當(dāng)前第43頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)44分泌性蛋白質(zhì)(secretoryproteins)穿過合成所在的細(xì)胞到其它組織細(xì)胞去的蛋白質(zhì)信號(hào)肽(signalpeptide)N-端的一段疏水氨基酸

10～40個(gè)氨基酸把合成的蛋白質(zhì)移向胞膜并與胞膜結(jié)合，然后把合成的蛋白質(zhì)送出胞外N-N端堿性疏水核心區(qū)

加工區(qū)-C

堿性氨基酸

極性和小側(cè)鏈氨基酸分泌蛋白當(dāng)前第44頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)45分泌性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制SRP:signalrecognitionparticles當(dāng)前第45頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)46信號(hào)肽識(shí)別顆粒信號(hào)肽(signalpeptide)當(dāng)前第46頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)47外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體線粒體蛋白的靶向輸送當(dāng)前第47頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)48細(xì)胞核蛋白的靶向輸送當(dāng)前第48頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)49分子生物學(xué)

MolecularBiology核酸的分子雜交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology當(dāng)前第49頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)50

堿基核苷核苷酸RNA

腺嘌呤（A）腺苷腺苷酸(AMP)

鳥嘌呤（G）鳥苷鳥苷酸(GMP)

胞嘧啶（C）胞苷胞苷酸(CMP)

尿嘧啶（U）尿苷尿苷酸(UMP)DNA

腺嘌呤（A）脫氧腺苷脫氧腺苷酸(dAMP)

鳥嘌呤（G）脫氧鳥苷脫氧鳥苷酸(dGMP)

胞嘧啶（C）脫氧胞苷脫氧胞苷酸(dCMP)

胸腺嘧啶（T）脫氧胸苷脫氧胸苷酸(dTMP)DNA和RNA的堿基﹑核苷和相應(yīng)的核苷酸當(dāng)前第50頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)51核苷酸之間連接當(dāng)前第51頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)52

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)當(dāng)前第52頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)53BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).當(dāng)前第53頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)54ContentofTable一、核酸分子雜交技術(shù)的原理二、核酸探針的制備三、核酸探針的標(biāo)記四、核酸分子雜交技術(shù)五、DNA芯片技術(shù)當(dāng)前第54頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)55一、核酸分子雜交技術(shù)的原理

有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe),

與變性后的單鏈基因組DNA或RNA等進(jìn)行雜交。用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。

當(dāng)前第55頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)56當(dāng)前第56頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)57當(dāng)前第57頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)58DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對(duì)的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。當(dāng)前第58頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)59溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱性及分子局部的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。增色效應(yīng)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時(shí)DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。當(dāng)前第59頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)60復(fù)性指變性DNA在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為"退火"(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。當(dāng)前第60頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)61

應(yīng)用：1）檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；2）用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。當(dāng)前第61頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)62影響雜交的因素核酸分子的濃度和長(zhǎng)度溫度離子強(qiáng)度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復(fù)雜性非特異性雜交反應(yīng)當(dāng)前第62頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)63

1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg，濃度過高影響雜交效率當(dāng)前第63頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)642、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低

20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm

值低5℃當(dāng)前第64頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)653、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

當(dāng)前第65頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)664、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68℃雜交當(dāng)前第66頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)675、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長(zhǎng)度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性當(dāng)前第67頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)686、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉當(dāng)前第68頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)69常用于預(yù)雜交的封閉物變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在交雜反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用小牛血清白蛋白。Home當(dāng)前第69頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)70二、核酸探針的制備探針（Probe):

一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。當(dāng)前第70頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)71理想的探針1.要加以標(biāo)記、帶有示蹤物，便于雜交后檢測(cè)和鑒定雜交分子。2.應(yīng)是單鏈，若為雙鏈用前需要先行變性為單鏈。3.具有高度特異性，只與靶核酸序列雜交，不與樣本中存在的其它核酸雜交。4.探針長(zhǎng)度一般是十幾個(gè)堿基不等，小片段探針較大片段探針雜交速率快。5.作為探針的核苷酸序列要選取基因編碼序列，避免用內(nèi)含子及其它非編碼序列。6.標(biāo)記的探針應(yīng)具有高靈敏度、穩(wěn)定，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便、安全。當(dāng)前第71頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)72(一）探針的分類據(jù)制備方法及核酸性質(zhì)不同，可分為：

基因組DNA探針（genomicprobe）

cDNA探針（cDNAprobe）

RNA探針（RNAprobe）寡核苷酸探針（oligonucleotideprobe)據(jù)探針標(biāo)記物的類型不同：同位素標(biāo)記的探針非同位素標(biāo)記的探針當(dāng)前第72頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)731、Genomicprobe

從基因組文庫中篩選和純化獲得的一個(gè)特定基因（或基因片段）的克隆片段。多為某一基因的全部或部分序列（含有內(nèi)含子序列），或某一非編碼序列，或某一外顯子序列。當(dāng)前第73頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)74①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。②DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。特點(diǎn)：當(dāng)前第74頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)75

cDNA（complementaryDNA）是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。這種DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。2、cDNAprobe當(dāng)前第75頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)76

采用基因克隆或體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得。有些病毒的基因組是RNA，分離后經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記可制成RNA探針。3、RNAprobe當(dāng)前第76頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)77RNA探針優(yōu)勢(shì)雜交的效率高，雜交體較穩(wěn)定。RNA中不存在高度重復(fù)序列，因此非特異性雜交較少。雜交后RNase將未雜交的探針分子消化掉，使本底降低。當(dāng)前第77頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)78

寡核苷酸探針是采用DNA合成儀人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。一般長(zhǎng)度為20～50個(gè)堿基。亦可根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)出核酸順序加以人工合成。4、oligonucleotideprobe當(dāng)前第78頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)79探針的制備方法探針長(zhǎng)度一般以50~300bp為宜。制備方法：1）利用DNA重組技術(shù)（基因組DNA探針制備）2）PCR擴(kuò)增（cDNA探針制備）3）化學(xué)合成（寡核苷酸探針制備）當(dāng)前第79頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)80制備基因組文庫細(xì)胞DNA酶切重組DNA篩選獲目的基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌，培養(yǎng)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary)。制備探針時(shí)，增殖細(xì)菌，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，用限制酶切，回收特定基因片段，經(jīng)標(biāo)記則成為基因組DNA探針。當(dāng)前第80頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)81ConstructionofaHumanGenomicLibrary當(dāng)前第81頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)82RestrictionEnzyme-ActionofEcoRI

當(dāng)前第82頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)83DNArecombination當(dāng)前第83頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)84cDNA探針制備逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA分離純化mRNAPCR擴(kuò)增當(dāng)前第84頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)85

根據(jù)已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段或根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)出核酸順序加以人工合成?；瘜W(xué)合成（寡核苷酸探針制備）Geneticcode當(dāng)前第85頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)86合成寡核苷酸探針注意原則：1）長(zhǎng)度（18-50bp);2）G:C對(duì)含量40%-60%；3）探針內(nèi)避免互補(bǔ)；4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；5）與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。Home當(dāng)前第86頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)87三、核酸探針的標(biāo)記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。當(dāng)前第87頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)88（一）標(biāo)記物

1、理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：1）標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;2）特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；3）操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；4）安全、無環(huán)境污染。當(dāng)前第88頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)89放射性核素非放射性標(biāo)記主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度和特異性極高，可檢出樣品中少于1000個(gè)分子的核酸量。缺點(diǎn)：半衰期短，穩(wěn)定性差，污染環(huán)境、檢測(cè)需時(shí)較長(zhǎng)。主要有：生物素、地高辛、辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶及FITC等。優(yōu)點(diǎn)：具有穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)及實(shí)驗(yàn)周期短等特點(diǎn)，近年來應(yīng)用越來越廣泛。缺點(diǎn)：靈敏度低于放射性核素標(biāo)記的探針2、標(biāo)記的種類當(dāng)前第89頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)90（二）探針的標(biāo)記方法放射性同位素標(biāo)記法缺口平移法(Nicktranslation)隨機(jī)引物延伸法(Randomprimerlabelling)末端標(biāo)記法(Endlabelling)非放射性同位素標(biāo)記法酶促標(biāo)記法、化學(xué)標(biāo)記法當(dāng)前第90頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)91缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`聚合酶活性和5`→3`外切酶活性相結(jié)合。DNAaseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時(shí)利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。

這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3`方向移動(dòng)，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。當(dāng)前第91頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)92切口移位（平移）法當(dāng)前第92頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)93當(dāng)前第93頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)94當(dāng)前第94頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)95隨機(jī)引物標(biāo)記法原理

用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷在其3`-OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。當(dāng)前第95頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)96當(dāng)前第96頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)97當(dāng)前第97頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)98末端標(biāo)記法原理（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的ddUTP。當(dāng)前第98頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)99末端標(biāo)記法當(dāng)前第99頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)100當(dāng)前第100頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)101非放射性同位素標(biāo)記法光敏生物素標(biāo)記核酸

由一個(gè)光敏基團(tuán)、一個(gè)連接臂和一個(gè)生物素基團(tuán)組成。光生物素的光敏基團(tuán)是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結(jié)合。酶促標(biāo)記法將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，利用酶促聚合反應(yīng)將其摻入到待標(biāo)記的探針分子中去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基團(tuán)交換到核酸分子上。當(dāng)前第101頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)102探針的純化1、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是SephadexG-503、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針當(dāng)前第102頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)103當(dāng)前第103頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)104核酸分子雜交信號(hào)的檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記探針：

放射自顯影。

非放射性同位素標(biāo)記探針：

偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。當(dāng)前第104頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)105放射自顯影

通過X光片檢測(cè)放射性核素標(biāo)記物。其基本原理為：同位素在不斷衰變過程中釋放出β-粒子，粒子撞擊X光片感光層，形成潛在影象，經(jīng)過顯影即可見到成像。當(dāng)前第105頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1061．偶聯(lián)反應(yīng)可以通過抗原-抗體免疫反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)。地高辛系類固醇半抗原化合物，地高辛標(biāo)記探針雜交信號(hào)可通過酶聯(lián)免疫法與抗地高辛抗體和堿性磷酸酶的復(fù)合物結(jié)合，再進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)。2．顯色反應(yīng)（1）酶促顯色法：最常用的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶（2）熒光法：熒光素探針主要用于原位雜交，最常用的為FITC。（3）化學(xué)發(fā)光法：化學(xué)發(fā)光指在化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的發(fā)光反應(yīng)。化學(xué)法檢測(cè)當(dāng)前第106頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)107當(dāng)前第107頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)108地高辛標(biāo)記探針雜交信號(hào)檢測(cè)Home當(dāng)前第108頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)109四、核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交

固相雜交液相雜交印跡雜交原位雜交固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測(cè)樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測(cè)樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。當(dāng)前第109頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)110菌落雜交(Colonyinsituhybridization)常用的固相雜交類型Southern印跡雜交(Southernblotting)

原位雜交(insituhybridization)其他類型雜交（Otherhybridization)斑點(diǎn)雜交(Dotblotting)Northern印跡雜交(Northernblotting)當(dāng)前第110頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)111核酸分子雜交的基本程序當(dāng)前第111頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)112

此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。

（一）Southern印跡雜交當(dāng)前第112頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)113PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無水乙醇離心當(dāng)前第113頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)114帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程當(dāng)前第114頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1151、待測(cè)核酸樣品的制備

⑴、裂解或破碎細(xì)胞⑵、抽取純化基因組DNA

⑶、限制酶消化DNA為大小不同的

DNA片段當(dāng)前第115頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1162、待測(cè)DNA樣品的電泳分離

⑴、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠

⑵、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快，大小相同的分子處于同一條帶

⑶、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記當(dāng)前第116頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1173、凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。4、Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。當(dāng)前第117頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)118固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能非特異吸附少當(dāng)前第118頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)119（2）常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子依靠疏水作用而吸附在膜上，結(jié)合不牢固

②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高

③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較低當(dāng)前第119頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)120當(dāng)前第120頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)121當(dāng)前第121頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)122當(dāng)前第122頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)123當(dāng)前第123頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)124Southern印跡的常用方法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。（1）毛細(xì)管虹吸印跡法當(dāng)前第124頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)125白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜當(dāng)前第125頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)126當(dāng)前第126頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)127（2）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。當(dāng)前第127頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)128真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉(zhuǎn)膜當(dāng)前第128頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)129當(dāng)前第129頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)130（3）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。當(dāng)前第130頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)131當(dāng)前第131頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)132

5、Southern雜交

⑴、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液。

⑵、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA

雜交，雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

⑶、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA。當(dāng)前第132頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1336、雜交結(jié)果檢測(cè)

1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針

2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針當(dāng)前第133頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)1347、Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析當(dāng)前第134頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)135（二）Northern印跡雜交

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、檢測(cè)目的RNA的存在與否及含量

3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA

這是經(jīng)典的RNA分析法，目前主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。當(dāng)前第135頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)136Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA當(dāng)前第136頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)137

←28S←18S

RNA電泳當(dāng)前第137頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)138當(dāng)前第138頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)139β-1，4糖基轉(zhuǎn)移酶在損傷坐骨神經(jīng)中的表達(dá)當(dāng)前第139頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)140Northern雜交的主要用途

主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。當(dāng)前第140頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)141（三）Western印跡雜交

檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法。當(dāng)前第141頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)142主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備PAGE電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：PVDF膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)當(dāng)前第142頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)143當(dāng)前第143頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)144當(dāng)前第144頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)145（四）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交Dotblottingandslotblotting原理：是將被檢標(biāo)本的RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣吸附于硝酸纖維膜上，然后用標(biāo)記探針與之雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。

優(yōu)點(diǎn)：用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣品用量少。缺點(diǎn)：不能鑒定所測(cè)基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。當(dāng)前第145頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)146當(dāng)前第146頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)147當(dāng)前第147頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)148(五）原位雜交insituhybridization

又分為菌落雜交或噬菌斑、以及真核細(xì)胞原位雜交。

它是利用標(biāo)記的已知核酸探針，在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術(shù)。組織細(xì)胞原位雜交是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸片段，它保持了細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組織的立體構(gòu)型，適合于核酸定位和分布研究。當(dāng)前第148頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)149核酸原位雜交的基本步驟當(dāng)前第149頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)150HPVFISH當(dāng)前第150頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)151菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。當(dāng)前第151頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)152當(dāng)前第152頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)153當(dāng)前第153頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)154液相雜交

指待測(cè)核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子的過程。RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法當(dāng)前第154頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)155（六）RNA酶保護(hù)分析法1、RNA酶保護(hù)分析法原理

RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測(cè)RNA互補(bǔ)形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護(hù)，稱RNA酶保護(hù)分析法。當(dāng)前第155頁\共有167頁\編于星期五\10點(diǎn)156

待測(cè)RNA樣品↓←單鏈RNA探針液相雜交↓