BD流式細胞儀全面介紹課件

流式細胞術(shù)簡介王苗苗流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細胞儀的工作原理待測細胞以單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。

流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。

流式細胞儀的工作原理

液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性前向角散射光——FSCFALSSensorLaser側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點圖”來看散射光信號

- 散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數(shù)據(jù)熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。熒光信號熒光檢測器FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector

定量染色熒光信號大小

被標(biāo)記組分含量的定量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量熒光信號與細胞特性光電倍增管（PMT），用來檢測從細胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號雙色反光鏡，通過反射一定范圍的光，透過其余光來實現(xiàn)分離作用濾光片，能透過一定波長的光，但是沒有反射功能，放著角度是與光束成90度。參與信號處理的光學(xué)元件460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass

Shortpass

Bandpass濾光片F(xiàn)ACSCalibur光路圖LaserFluorochromesDetectorParameterFilterFITCGFPFL1530/30PEPIFL2585/42PerCPPerCP-CY5.5FL3670LPAPCFL4661/16488nm635nmFCM測量數(shù)據(jù)的顯示與分析幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。脈沖寬度（pulsewidth）表示細胞的粘連情況脈沖面積（pulsearea）主要用于DNA的含量測定FL1、…..、FL13等表示細胞在各檢測波長的熒光信號Time

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0FL2-A表示在FL2通道上以熒光強度對細胞數(shù)作積分，用面積來計算處于不同時相的細胞的總數(shù)。數(shù)據(jù)顯示:

直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖、三維圖等,

最常用的為散點圖和直方圖。圖報告中常見的幾種流式細胞圖散點圖密度圖二維等高圖直方圖圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細胞凋亡和壞死單參數(shù)直方圖每一個細胞單參數(shù)的測量數(shù)據(jù)可整理成分布統(tǒng)計，以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細胞數(shù)。直方圖分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示是用于表達來自同一細胞兩個參數(shù)與細胞數(shù)量的關(guān)系，常用的表達方法有二維點圖(dotplot)、等高線圖(contourplot)、二維密度圖(densityplot)。在二維圖中，x坐標(biāo)為某細胞一個參數(shù)的數(shù)值，而Y坐標(biāo)為該細胞另一參數(shù)的數(shù)值。從雙參數(shù)圖形中可以將各細胞亞群區(qū)分開，同時可獲得細胞相關(guān)的重要信息。外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖等高圖和密度圖分析三維圖分析細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞凋亡流式細胞儀的細胞學(xué)應(yīng)用流式細胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病細胞DNA,RNA含量的測定染色體倍體分析染色體分離基因表達產(chǎn)物的生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表達的生物效應(yīng)基因表達調(diào)控研究細胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選報告基因的定性定量檢測植物遺傳學(xué)研究??????流式細胞儀的遺傳學(xué)應(yīng)用Flowcytometryofapoptoticcelldeath細胞散射光在細胞調(diào)亡中，細胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒有明顯變化Flowcytometryofapoptoticcelldeath熒光吸收細胞的胞膜對于DNA染料的通透性和細胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來區(qū)分活細胞、死細胞和凋亡細胞Viabilitywasmeasuredasimpermeabilitytopropidiumiodide.Flowcytometryofapoptoticcelldeath細胞DNA含量

在凋亡細胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細胞，其染色熒光強度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細胞內(nèi)DNA含量下降造成的。DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

Flowcytometryofapoptoticcelldeath線粒體功能的變化使用有膜穿透性的親脂性陽離子熒光染料，如Rho123,DiOC6,JC-1等，可作為流式