CHIP1-教學講解課件

染色質(zhì)免疫沉淀及其測序Chip-seq王雅琪1ppt課件目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應用優(yōu)缺點測序2ppt課件一、簡介ChIP

是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關系。3ppt課件二、原理染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）的基本原理是在活細胞狀態(tài)下把細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。4ppt課件技術(shù)示意圖5ppt課件三、技術(shù)流程具體操作流程6ppt課件1、甲醛交聯(lián)細胞具體步驟7ppt課件2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min。每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。(不同樣本都進行超聲條件優(yōu)化實驗)3.14000rpm離心10min(4℃)，轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。8ppt課件3、免疫沉淀蛋白和DNA復合物9ppt課件4、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）10ppt課件5、洗脫免疫復合物11ppt課件6、去除甲醛交聯(lián)解交聯(lián)：加入20ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M).混勻,65℃,解交聯(lián)過夜。12ppt課件7、DNA純化1、酚-氯仿抽提2、硅膠柱純化13ppt課件8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定1.如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法14ppt課件四、應用1.組蛋白修飾研究2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥物開發(fā)研究4.有絲分裂研究5.DNA損傷與凋亡分析15ppt課件五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實情況，可以找出生理條件下某個DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點，從而反映體內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。缺點：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難以獲得；為了獲得高等豐度的結(jié)合片段，必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標蛋白質(zhì)的表達情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因獲取可能需要限制在組織來源。16ppt課件注意事項1、抗體與目的蛋白結(jié)合的有效性和特異性ChIP所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結(jié)果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實驗的，只有經(jīng)過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結(jié)果的可靠性。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測。17ppt課件2、交聯(lián)的條件交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%，而交聯(lián)時間需要預實驗來確定。通常的交聯(lián)條件為室溫10min。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。18ppt課件3、超聲片段的大小打斷后的染色質(zhì)片段的長度應主要集中在200-1000bp左右。19ppt課件六、測序ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。20ppt課件應用領域（1）判斷DNA鏈的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾；（