DNA的復制和修復課件

第十二章DNA的復制和修復

本章重點介紹中心法則和DNA的半保留復制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機理，對DNA的損傷和修復、突變和重組作一般介紹。

知識點回顧

什么是DNA？DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎，是遺傳信息的載體。生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。

DNA的結(jié)構(gòu)特征？雙螺旋結(jié)構(gòu)含兩條多核苷酸的雙螺旋分子。Watson-Crick模型

什么是DNA變性、復性和雜交

？DNA變性指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。DNA復性變性DNA在適當條件下,兩條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，又稱“退火”。雜交

DNA復性過程中不同來源的DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。那么，DNA是如何參與遺傳信息傳遞的

？中心法則1958年Crick稱之為中心法則。DNA的生物合成：細胞內(nèi)合成DNA的過程1、復制：以DNA作為模板指導的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。2、反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導合成作用，見于RNA病毒。3、修復合成：當各種因素引起DNA損傷時，損傷DNA可修復合成，校正錯誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準確性。第一節(jié)DNA復制

一、復制的特征（一）半保留復制兩個子代分子中各有一條鏈來自親代，各有另一條新合成的鏈，這種復制方式叫半保留復制。[實驗證據(jù)]：1957年M.Meselson

和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4Cl中培養(yǎng)證實了半保留復制方式。Cscl梯度離心的結(jié)果。（二）復制的起始點與方向

親代DNA開鏈，復制起始點呈叉型移動1、復制起點：DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起點。單復制子多復制子（三）半不連續(xù)合成在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另一條鏈是不連續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化5’3’合成的DNA聚合酶。60年代，岡琦片段的發(fā)現(xiàn)：合成5’3’前導鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復制叉一致。合成3’

5’隨從鏈時，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。在DNA復制時，1條鏈的合成方向和復制叉的前進方向相同，可以連續(xù)復制，叫作前導鏈；而另一條鏈的合成方向和復制叉的前進方向正好相反，不能連續(xù)復制，只能分成幾個片段(岡崎片段)合成，稱之為滯后鏈。

（四）DNA聚合反應有關的酶①TopoI和TopoII②解鏈酶和SSB的作用2引物酶合成RNA引物3DNA聚合酶延長子鏈E.Coli的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶水解引物并填補空隙4DNA連接酶連接岡崎片段第二節(jié)DNA生物合成過程DNA復制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。

1．解旋解鏈，形成復制叉：由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。一、復制的起始2．引發(fā)體組裝和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復制起始區(qū)域形成引發(fā)體；在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

二、復制的延長

復制的延長指在DNA聚合酶催化下，以3’→5’方向的親代DNA鏈為模板，從5’→3’方向聚合子代DNA鏈。其化學本質(zhì)是dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，磷酸二酯鍵不斷生成。在原核生物中，參與DNA復制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中是DNA聚合酶δ。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA復制的延長過程領頭鏈的合成過程隨從鏈的合成過程DNA聚合酶Ⅲ催化領頭鏈和隨從鏈同時合成DNA復制過程簡圖三、復制的終止在復制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延長缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。（一）去除引物，填補缺口：在DNA連接酶的催化下，生成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。（二）連接岡崎片段：555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接DNA復制的過程端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。（三）真核生物端粒的形成：功能?維持染色體的穩(wěn)定性?保證DNA復制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。53355335端粒酶(telomerase)端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。端粒酶的分子結(jié)構(gòu)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

端粒酶的組成端粒酶(telomerase)的作用機制——爬行模型端粒酶的爬行模型（動畫演示）人的生殖細胞和癌細胞中，可以檢測到端粒酶活性；而在多數(shù)的體細胞中，未檢測到端粒酶活性(Kimetal,1994Science)。在人的永生化細胞中抑制端粒酶的活性，將導致端粒縮短并最終導致細胞死亡(Herbertetal1999PNAS)在多數(shù)人的體細胞中，端粒隨著細胞傳代而漸漸縮短。將端粒酶導入到人的正常細胞中，細胞在體外至少可以多傳20代(Bodnaretal,1998Science)Werner綜合癥早老綜合癥是位于8號染色體短臂的一種DNA解旋酶基因突變

端粒在對于保持染色體穩(wěn)定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒（縮短的端粒其細胞復制能力受限），從而增強體外細胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，端粒酶可能參與惡性轉(zhuǎn)化。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復制方式Section4ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制滾環(huán)復制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的復制形式，如X174和M13噬菌體等。35553335'滾環(huán)復制的過程3-OH5-P5'5335D環(huán)復制(D-loopreplication)：是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復制形式。dNTPDNA-pol

γ

第四節(jié)DNA的損傷（突變）與修復

由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。

一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎（一）自發(fā)因素：1.自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達近萬個核苷酸殘基。2.自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達幾十到幾百個核苷酸殘基。3.復制錯配：由于復制時堿基配對錯誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。二、引起突變的因素胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）

由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復制障礙。（二）物理因素：嘧啶二聚體的形成UV1.脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成H。

（三）化學因素：2.烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。3.DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結(jié)合引起損傷。4.堿基類似物：如5-FU，6-MP等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。5.斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。三、突變的分子改變類型DNA分子上單一堿基的改變稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因血紅蛋白-亞基的點突變3.缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。4.插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。移碼突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導致移碼突變。谷酪蛋絲5’……GC

A

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GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

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AUG

UC……缺失C缺失引起的框移突變5.重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型四、DNA損傷的修復DNA損傷修復(repair)：是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其盡可能回復為原有的天然狀態(tài)。光修復(lightrepair)切除修復(excisionrepair)重組修復(recombinationrepair)SOS修復

修復的主要類型：無差錯修復有差錯傾向修復這是一種廣泛存在的修復作用，能夠修復任何嘧啶二聚體的損傷。修復過程由光修復酶(photolyase)催化完成。（一）光修復（lightrepair）：光修復酶的分子結(jié)構(gòu)光其修復過程為：光修復酶(photolyase)識別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復合物。在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開。光修復酶從DNA上解離。

1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放DNA紫外線損傷的光裂合酶修復這也是一種廣泛存在的修復機制，可適用于多種DNA損傷的修復。切除修復機制的基本過程是將受損的DNA片段切除，然后再以對側(cè)鏈為模板，重新合成新鏈進行修復。（二）切除修復(excisionrepair)：在原核生物中，與DNA切除修復有關的蛋白質(zhì)包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApolⅠ和DNA連接酶。UvrA和UvrB主要起辨認和結(jié)合受損部位的作用；而UvrC則主要與受損片段的切除有關。DNA的損傷和切除修復堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復連接糖苷酶插入酶堿基取代