精選生物技術藥物制劑和疫苗講義

（優(yōu)選）生物技術藥物制劑與疫苗課件當前第1頁\共有40頁\編于星期五\11點Contents生物技術藥物制劑概述蛋白質類藥物制劑的處方與工藝蛋白質類藥物新型給藥系統蛋白質類藥物制劑的評價方法4123

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疫苗

當前第2頁\共有40頁\編于星期五\11點一、概述生物技術：是應用生物體或其組成部分，在最適條件下，生產有價值的產物或進行有益過程的技術。主要包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程。生物技術藥物制劑是指采用現代生物技術,借助某些微生物、植物、動物生產的藥品。當前第3頁\共有40頁\編于星期五\11點生物技術藥物研究概況生物技術藥物產品，目前國內外已批準上市的約40余種，正在研究的有數百種之多，這些藥物均屬肽類與蛋白質類藥物。我國已上市的基因工程藥物和疫苗

1995年白細胞介素-21996年α1b-干擾素α2a-干擾素

α2b-干擾素

1997年粒細胞集落因子紅細胞生成素

1992年乙型肝炎疫苗當前第4頁\共有40頁\編于星期五\11點生物技術藥物的結構特點與理化性質蛋白質的組成和一般結構蛋白質是由許多氨基酸按一定順序排列，通過肽鍵相連而成的多肽鏈。蛋白質的高級結構 包括二級、三級與四級結構。當前第5頁\共有40頁\編于星期五\11點當前第6頁\共有40頁\編于星期五\11點蛋白質的理化性質1、蛋白質的一般理化性質旋光性：由螺旋結構引起，通常為右旋紫外吸收：苯核在280nm有最大吸收，氨基酸在230nm顯強吸收蛋白質兩性性質與電學性質：在不同pH下會成為陽離子，陰離子或兩性離子當前第7頁\共有40頁\編于星期五\11點2、蛋白質的不穩(wěn)定性由于共價鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質的水解蛋白質的氧化外消旋作用二硫鍵斷裂及其交換由非共價鍵引起的不穩(wěn)定性：聚集宏觀沉淀表面吸附蛋白質變性蛋白質的理化性質蛋白質的穩(wěn)定性對于蛋白質類藥物的制劑研究、生產、貯存等極為重要。

當前第8頁\共有40頁\編于星期五\11點蛋白質類藥物的評價方法液相色譜法：RP-HPLC,IEC,SEC光譜法:UV,可見吸收光譜，ORD,CD,熒光，IR,拉曼光譜電泳：SDS,IEF,EC生物活性測定與免疫測定:重組DNA和雜交瘤技術產品應進行生物活性的測定，蛋白質藥物制劑的穩(wěn)定性也應檢測其生物活性。

生物活性檢測是利用體內模型或體外組織或活性蛋白質多肽的特異性生物學反應，通過劑量（或濃度）效應曲線進行定量（絕對量或比活性單位）。免疫測定通常采用免疫化學法在前面討論蛋白質藥物不穩(wěn)定的原因時已經看出，要開發(fā)蛋白質類藥物，需要多種分析方法。

當前第9頁\共有40頁\編于星期五\11點二、蛋白質類藥物制劑的處方與工藝蛋白類藥物的一般處方組成蛋白類注射劑包括：溶液型注射劑：使用方便，需低溫保存凍干粉注射劑：穩(wěn)定，但工藝復雜液體劑型中蛋白類藥物的穩(wěn)定化方法改造其結構加適宜輔料（通過加入各類輔料，改變蛋白類藥物溶劑的性質是藥物制劑中常用的穩(wěn)定化方法。）蛋白質類藥物制劑的研制關鍵是解決這類藥物的穩(wěn)定性問題。對于注射給藥則采用適當的輔料，設計合理的處方與工藝，而非注射給藥還需解決生物利用度問題。

當前第10頁\共有40頁\編于星期五\11點蛋白類藥物的穩(wěn)定劑有緩沖液：枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖劑，磷酸鹽緩沖系統表面活性劑：非離子型表面活性劑，如吐溫80糖和多元醇：蔗糖，海藻糖，山梨醇等鹽類：常用NaCl聚乙二醇類：如PEG200、300、400、600、1000大分子化合物：HSA(人血清蛋白)組氨酸、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸的鹽酸鹽等金屬離子：鈣、鎂、鋅等當前第11頁\共有40頁\編于星期五\11點固體狀態(tài)蛋白質藥物的穩(wěn)定性與工藝冷凍干燥蛋白質藥物制劑

需考慮的問題：選擇適宜輔料輔料對冷凍干燥過程中一些參數的影響凍干保護劑：甘露醇，山梨醇，蔗糖，葡萄糖，右旋糖酐等噴霧干燥蛋白質藥物制劑：噴霧干燥工藝廣泛應用于蛋白質類藥物的控釋制劑、吸入劑、微球制劑等新型給藥系統的研制中。在噴霧干燥過程中可加入穩(wěn)定劑，如蔗糖能提高氧血紅蛋白（oxyhemoglobin）的穩(wěn)定性。缺點是操作過程中損失大，水分含量高當前第12頁\共有40頁\編于星期五\11點高分子聚合物中蛋白質藥物的穩(wěn)定化蛋白質藥物穩(wěn)定性藥物的不穩(wěn)定性通常發(fā)生在制備、儲存和釋放過程中蛋白質藥物不穩(wěn)定機理有：蛋白分子的伸展；水溶性或水不溶性聚集；水解；脫氨和氧化在應用W/O/W復乳溶劑揮發(fā)法制備PLGA微球時加入穩(wěn)定劑BSA或海藻糖可有效提高蛋白質穩(wěn)定性。當前第13頁\共有40頁\編于星期五\11點包封在聚合物中的蛋白質藥物在釋放過程中影響穩(wěn)定性的因素含水量微環(huán)境的pH聚合物表面吸附次要因素：水溶性低聚物，滲析效應，蛋白與聚合物之間的直接反應當前第14頁\共有40頁\編于星期五\11點使穩(wěn)定性研究簡化的途徑和方法模型蛋白的選用：如以核糖核酸酶A作為模型藥物研究蛋白質不穩(wěn)定性機理聚合物中蛋白質結構的模擬和修飾：模擬蛋白質所處的不利條件以及不穩(wěn)定機理可用以闡述在蛋白的提取過程之外的不穩(wěn)定因素。選用不同的聚合物骨架：采用較大幾何形狀的微柱體來簡化蛋白質穩(wěn)定性的研究與評價。當前第15頁\共有40頁\編于星期五\11點由濕度引起的不穩(wěn)定性改變固體藥物中的含水量，是蛋白質處于非伸展狀態(tài)以及直接阻斷其不穩(wěn)定機制。鋅離子與人生長激素形成不溶性沉淀可提高蛋白質穩(wěn)定性加入添加劑，可以改變聚合物的吸水量兩種常見共價聚集的機制：固體蛋白質在濕環(huán)境中二硫鍵的破環(huán)由甲醛介導的聚集過程當前第16頁\共有40頁\編于星期五\11點由酸誘導的蛋白不穩(wěn)定性提高PLGA包封蛋白穩(wěn)定性的最直接方法是調節(jié)處方以提高微環(huán)境的pH值。避免由酸誘導的BSA的物理聚集的方法增加聚合物的通透性，從而使PLGA的水解產物——水溶性酸釋放出來降低聚酯的降解速率加入適當添加劑，中和聚合物的降解產物——弱酸當前第17頁\共有40頁\編于星期五\11點三、蛋白質類藥物新型給藥系統新型注射（植入）給藥系統

臨床經驗表明，很多蛋白質類藥物在體內血漿半衰期短，清除率高，因而需要延長其在體內的平均駐留時間，或改變蛋白質在體內的藥物動力學性質，有時需要制成非零級脈沖式釋藥系統（如疫苗）。為滿足這些要求，既可以對蛋白質分子進行化學修飾，也可以控制蛋白質進入血流的釋放速度等。目前已有用PEG修飾蛋白質分子以延長蛋白質藥物在血漿中的半衰期。例如，腺苷酸脫氨酶（adenosinedeaminase，ADA）即采用形成PEG-ADA這種方法，治療因ADA缺乏而引起免疫缺損綜合征的患者，此藥已經獲FDA批準生產?？蒯屛⑶蛑苿菏状谓汧DA批準的蛋白質類藥物微球制劑是醋酸亮丙瑞林（leuprolideacetate）聚丙交酯—乙交酯微球。此種微球供肌內注射，用于治療前列腺癌，可控制釋放達30d之久，改變了普通注射劑需每天注射的傳統，使用方便。當前第18頁\共有40頁\編于星期五\11點控釋微球制劑常用制備方法復乳液中干燥法（γ干擾素、白細胞介素、亮丙瑞林、人生長激素、環(huán)孢素以及促紅細胞生長素（EPO）等）低溫噴霧提取法噴霧干燥法超臨界萃取法脈沖式給藥系統：如疫苗或類毒素等抗原蛋白當前第19頁\共有40頁\編于星期五\11點白細胞介素1α（IL-1α）PLGA微球的制備：LimorChen等以改良的復乳溶劑揮發(fā)法制備。具體方法為：將含有20mg牛血清白蛋白（BSA）和8.5μgIL-1α的水溶液50μl與含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探針式超聲乳化（56w）30s，將此初乳分散于1ml用二氯甲烷飽和的1%（w/v）PVA水溶液中，漩渦混懸形成復乳，再將該復乳傾入50ml0.1%（w/w）PVA水溶液中攪拌5min，再加入50ml含有10%（v/v）2-丙醇的PVA溶液將二氯甲烷抽提到外水相中，連續(xù)攪拌30min后，離心10min收集微球，冰凍干燥成流動性粉末狀微球。由于皮下注射微球后小于10μm微球易被巨噬細胞吞噬，故需將微球粒徑控制在10μm以上。制備過程中界面張力影響IL-1α的活性，加入0.5%（w/w）磷脂酰膽堿（PC）可保護IL-1α，并顯著減小微球的粒徑。微球的體外釋放度試驗表明，牛血清白蛋白和白細胞介素1α在30min鐘內分別釋放38%和63%，40d內分別釋放75%和100%。掃描電鏡顯示，突釋后的釋藥過程與骨架的溶蝕過程同時進行。當前第20頁\共有40頁\編于星期五\11點非注射給藥系統

研究非注射途徑的給藥系統，將有益于增加病人的順應性（compliance）。蛋白質和多肽類藥物的非注射給藥方式包括鼻腔、口服、直腸、口腔、透皮和肺部給藥。目前最有應用前景的屬鼻腔給藥，然而口服給藥還是最受歡迎的給藥途徑，但難度很大。蛋白質和多肽類藥物的非注射給藥系統存在的主要問題是藥物透過黏膜能力差，易受酶的降解，以致生物利用度很低。提高生物利用度的方法：對藥物進行化學修飾或制成前體藥物應用吸收促進劑使用酶抑制劑采用離子電滲法皮膚給藥當前第21頁\共有40頁\編于星期五\11點鼻腔給藥系統鼻腔黏膜的特點：鼻腔給藥系統存在的問題：吸收促進劑動靜脈和毛細淋巴管豐富，大量微小絨毛，穿透性高，酶少，有利于藥物吸收分子量大的藥物透過性差，生物利用度低，吸收不規(guī)則，局部刺激性，妨礙絨毛運動，長期給藥的毒性膽酸鹽類，脂肪酸及其酯類，其他。當前第22頁\共有40頁\編于星期五\11點胰島素鼻腔給藥系統已進行廣泛的研究，胰島素不用促進劑經鼻腔給藥生物利用度小于1％，但用葡萄糖膽酸酯作吸收促進劑，其生物利用度可提高到10％~30％。近年來有報道將胰島素制成淀粉微球，微球直徑45m，以0.751U／kg和1.71U／kg劑量噴入鼠鼻腔，達峰時為8min，30~40分鐘后，血糖分別下降40％和64％，維持時間4小時，生物利用度約為30％。當前第23頁\共有40頁\編于星期五\11點口服給藥系統（胰島素）

存在問題：受胃酸的催化降解；受胃腸道內酶的降解；對胃腸道黏膜的透過性差；受肝臟的首過作用微乳制劑：如自乳化的胰島素油溶液納米囊和納米粒：如胰島素聚氰基丙烯酸異丁酯納米囊胰島素腸溶膠囊生物黏附材料與腸溶材料的聯合應用技術：殼聚糖胰島素脂質體新型吸收促進劑的應用：SNAC當前第24頁\共有40頁\編于星期五\11點其他給藥系統直腸給藥系統特點：水解酶活性較低，pH接近中性，避免肝首過效應，一般采用吸收促進劑結腸定位給藥系統(OCDDS)口腔黏膜給藥系統：避免胃腸消化及肝首過效應當前第25頁\共有40頁\編于星期五\11點經皮給藥系統：離子導入技術：指電荷或中性分子在電場作用下遷移進皮膚的過程。肺部給藥系統：存在問題：長期給藥后安全性評估；肺吸收分子大小的限值；促進吸收的措施；穩(wěn)定的蛋白質藥物的處方設計方法當前第26頁\共有40頁\編于星期五\11點四、蛋白質類藥物制劑的評價方法4.1制劑中藥物的含量測定提取技術：不能測定包括不溶性聚集蛋白在內的蛋白總量水解技術：在堿性條件下的水解最為常用含量測定方法：紫外分光光度法反相高效液相色譜法：RP-HPLC,IES,SEC法BCA法和MicroBCA法當前第27頁\共有40頁\編于星期五\11點4.2制劑中藥物的活性測定酶聯免疫法是建立在蛋白質類藥物的活性部位與抗原決定簇處在相同部位時實施的一種方法。體外藥效學方法利用體外細胞與活性蛋白質多肽的特異生物學反應，通過劑量（或濃度）效應曲線進行定量。是制定藥物制劑質量標準最基本的方法。體內藥效學方法將藥物給予動物或人體后所反應出的藥效學反應。當前第28頁\共有40頁\編于星期五\11點4.3制劑中藥物的體外釋藥速率的測定

蛋白質藥物的體內外釋藥速率的測定方法具體方法：將數個試驗組的微球（每個試驗組設置數個取樣點）置于一定量的溶出介質中，放入37℃振動孵箱中，定時取樣離心分離測定微球中藥物含量。影響釋放的因素有：介質pH，離子強度，賦形劑，轉速，溫度等。當前第29頁\共有40頁\編于星期五\11點影響藥物釋放行為的因素（以微球為例）聚合物的影響聚合物中藥物釋放的機制：擴散機制和降解機制聚合物的組成對釋放的影響聚合物分子量對釋放的影響聚合物結構對釋放的影響聚合物與藥物的相互作用對釋放的影響當前第30頁\共有40頁\編于星期五\11點藥物對釋放的影響載藥量對釋放的影響高載藥量的微球突釋及累積釋放都顯著高于低載藥量微球。藥物穩(wěn)定性對釋放的影響蛋白類藥物極易在微球內部聚集稱為不溶性沉淀而影響藥物釋放。當前第31頁\共有40頁\編于星期五\11點制備工藝對釋放的影響復乳法制備工藝：制備初乳時蛋白質發(fā)生不可逆聚集，造成釋放不完全。部分無水法制備工藝低溫噴霧提取法制備工藝噴霧干燥法制備工藝附加劑對釋放的影響當前第32頁\共有40頁\編于星期五\11點4.4制劑的穩(wěn)定性研究：物理穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性4.5體內藥動學研究：對于非靜脈給藥的控緩釋制劑的體內藥動學試驗可考慮選擇放射標記法測定血漿中藥物的量，該方法靈敏度高，適合多數蛋白質類藥物體內血藥濃度的測定。

4.6刺激性及生物相容性研究：根據我國SFDA（StateFoodandDrugAdministration）藥品注冊管理辦法規(guī)定，皮膚、粘膜及各類腔道用藥需進行局部毒性和刺激性試驗，各類注射（植入）途徑給藥劑型除進行局部毒性和刺激性試驗外還需進行所用輔料的生物相容性研究，以確保所用輔料的安全性。當前第33頁\共有40頁\編于星期五\11點參考文獻[1]姜忠義，高蓉，許松偉等.藥物蛋白的聚乙二醇修飾.中國藥學雜志,2002，37（6）：409[2]瞿文，陳慶華，趙瑞欽等.丙氨瑞林生物可降解緩釋微球注射劑的研究.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2000,31（1）：14~18[3]畢殿洲主編，藥劑學.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999[4]吳瓊珠等．小鼠口服胰島素復乳后降血糖效果的實驗研究．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1990，21：445當前第34頁\共有40頁\編于星期五\11點Section2疫苗是指為了預防、控制傳染病的發(fā)生、流行，用于人體預防接種的疫苗類預防性生物制品。預防接種用的生物制品包括疫苗、菌苗和類毒素。疫苗（vaccine）分為兩類。原理：疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。

政府自愿、自費當前第35頁\共有40頁\編于星期五\11點種類人工主動免疫制劑1.滅活疫苗（甲肝滅活疫苗，就是死疫苗）2.減毒活疫苗（水痘疫苗是減毒活疫苗，麻風、腮腺炎疫苗都是屬于活疫苗）3.類毒素（白喉類毒素、破傷風類毒素等）人工被動免疫制劑1.抗毒素2.人免疫球蛋白制劑3.細胞因子制劑4.單克隆抗體制劑人工主動免疫和人工被動免疫均能使機體增加抗病能力，但后者的持續(xù)時間短，主要用治療和緊急預防。當前第36頁\共有40頁\編于星期五\11點新型疫苗1.亞單位疫苗（subunitvaccine）2.結合疫苗3.合成肽疫苗4.基因工程疫苗（1）重組抗原疫苗（2）重組載體疫苗（3）DNA/RNA疫苗（4）轉基因植物疫苗當前第37頁\共有40頁\編于星期五\11點兒童注射疫苗按照我國規(guī)定的計劃免疫程序，寶寶必須在1歲內完成5種疫苗的接種，具體包括以下幾種：乙肝疫苗一般在出生兩天內、1個月、6個月各注射1次，每3～5年加強注射1次。目前使用的多為基因工程乙肝疫苗，它可以用于預防所有已知亞型的乙肝病毒感染。不能接種該種疫苗的寶寶有：1.發(fā)熱、患急性傳染病、中耳炎