肝膽生化及檢測

第九章肝膽生化及檢測第一節(jié)概述一、肝臟結(jié)構(gòu)（一）解剖學(xué)特點(diǎn)雙重血液供應(yīng)腹主動(dòng)脈的分技肝動(dòng)脈氧門靜脈營養(yǎng)雙重輸出管道肝靜脈代謝降解物

下腔靜脈膽道系統(tǒng)脂溶性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物體外（二）肝臟的顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、組織結(jié)構(gòu)2、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（三

）細(xì)胞的再生二、肝臟的生物化學(xué)功能排泄功能物質(zhì)代謝功能生物轉(zhuǎn)化重要生化功能（一）排泄功能主要排泄對象：膽汁酸、膽紅素、氨1、膽汁酸代謝（1）膽汁的分泌：膽汁功能：促進(jìn)脂類的消化吸收，同時(shí)能將體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物及生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不斷地排入腸道隨糞便排出體外。膽汁的來源：肝膽汁膽囊膽汁十二指腸膽汁的成分：水/膽汁酸（鹽）、卵磷脂、蛋白質(zhì)、脂肪酸和膽固醇（2）膽汁酸生成及種類：初級膽汁酸（肝細(xì)胞）次級膽汁酸（腸道）初級游離膽汁酸初級結(jié)合膽汁酸（甘氨酸/牛磺酸）次級游離膽汁酸次級結(jié)合膽汁酸（甘氨酸/?；撬幔?）膽汁酸肝腸循環(huán)：（4）膽汁酸的功能：①促進(jìn)脂類消化②促進(jìn)脂類吸收③抑制膽固醇從膽汁中析出沉淀游離型膽汁酸結(jié)合型膽汁酸2、膽紅素代謝膽色素

尿膽素原糞膽素原尿膽素糞膽素膽綠素膽紅素未結(jié)合膽紅素(單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)如骨髓、脾臟)結(jié)合膽紅素（肝臟）膽素原部位——肝臟細(xì)胞鳥氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸代琥珀酸ATPAMP+PPi延胡索酸鳥氨酸精氨酸H2O尿素天門冬氨酸NH3CO2氨甲酰磷酸+H2O尿素循環(huán)（二）物質(zhì)代謝功能1、營養(yǎng)物質(zhì)代謝2、激素及維生素代謝(1)在蛋白質(zhì)代謝中的作用(2)在氨基酸代謝中的作用(3)在糖代謝中的作用(4)在脂代謝中的作用激素的滅活主要在肝臟進(jìn)行多種維生素能在肝細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存并進(jìn)行轉(zhuǎn)化三、肝臟疾病的生化改變（一）膽紅素代謝障礙（黃疸）定義:黃疸分類:黃疸和阻塞性黃疸溶血性黃疸肝細(xì)胞性黃疸高膽紅素血癥（二）膽汁酸代謝障礙1、膽汁酸合成障礙2、膽汁酸向腸道排出障礙3．膽汁酸腸肝循環(huán)紊亂4．膽汁瘀積病變時(shí)膽汁酸代謝紊亂（三）血漿酶異常1．肝臟合成酶類:膽堿脂酶、凝血因子、銅藍(lán)蛋白；2.肝細(xì)胞內(nèi)酶:

ALT、AST

3．肝臟阻塞性疾病酶活性改變：ALP、GGT4．肝硬化疾病酶活性改變：單胺氧化酶（MAO）

（四）血漿蛋白異常第二節(jié)肝功能試驗(yàn)血清（漿）蛋白測定血清酶測定血清膽紅素測定血清膽汁酸測定血氨測定血清酶測定（一）氨基轉(zhuǎn)移酶測定1．賴氏法測定ALT（１）原理：

ALT催化丙氨酸(alamine)與α-酮戊二酸(α-oxoglutarate)之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成丙酮酸(pyruvate)和谷氨酸(glutamate)。

在37℃及pH7.4條件下反應(yīng)30min，以2，4-二硝基苯肼終止反應(yīng)，并與底物α-酮戊二酸和產(chǎn)物α-丙酮酸的羰基生成2，4-二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下生成紅棕色，與505nm波長處讀取吸光度后計(jì)算活性。（２）方法評價(jià)：①賴氏法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需與卡門分光法的結(jié)果對比后求出；②NaOH的濃度對顯色有影響；③該法的重復(fù)性差?！緟⒖挤秶?/p>

5～25卡門氏單位【臨床意義】(2)慢性活動(dòng)性肝炎或脂肪肝：(1)肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo):ALT輕度增高(100～200IU),或?qū)僬７秶?2.連續(xù)監(jiān)測法測定ALT（１）原理：

采用酶偶聯(lián)反應(yīng),即L-丙氨酸和α-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸和L-谷氨酸。丙酮酸再在LD作用下生成L-乳酸，同時(shí)NADH被氧化為NAD+,可在340nm處連續(xù)監(jiān)測到NADH的消耗量,從而計(jì)算出ALT活性濃度。

雙試劑法

:首先使血清與缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保溫5分鐘，將標(biāo)本中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入α-酮戊二酸啟動(dòng)ALT催化的反應(yīng)，在波長340nm處連續(xù)監(jiān)測吸光度下降速率。根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-△A/min)，來計(jì)算ALT的活性。（２）方法評價(jià)：①存在著兩個(gè)副反應(yīng)，會(huì)使測定結(jié)果偏高；A、血清中存在的α-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。B、血清中谷氨酸脫氫酶(GLDH)增高時(shí)，在有氨存在條件下，亦能消耗NADH。

②雙試劑法，因溫育期長，能有效地消除干擾反應(yīng)，測定準(zhǔn)確性高，是ALT測定的首選方法；③血清不宜反復(fù)冰凍保存，以免影響酶活性；避免使用溶血標(biāo)本。3.賴氏法測定AST（１）原理：

血清中的AST可催化門冬氨酸(aspartate)與α-酮戊二酸間的氨基移換，生成草酸乙酸(oxaloacetate)和L-谷氨酸。草酸乙酸自行脫羧轉(zhuǎn)變成為丙酮酸。反應(yīng)60分鐘后，加入2，4-二硝基苯肼終止反應(yīng)，并與酮酸生反應(yīng)生成兩種2，4-二硝基苯腙。在堿性條件下,兩種苯腙的吸收光譜曲線有差別，在505nm處差異最大，由草酸乙酸轉(zhuǎn)變成的丙酮酸所生成的苯腙呈色強(qiáng)度顯著大于α-酮戊二酸苯腙。據(jù)此可用比色法測定AST活性。

（２）方法評價(jià)：①賴氏法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需與卡門分光法的結(jié)果對比后求出；②該法的重復(fù)性差：負(fù)干擾現(xiàn)象【參考范圍】

8～28卡門氏單位【臨床意義】肌炎、胸膜炎、腎炎及肺炎：血清AST也可輕度增高。心肌梗死：血清中AST活性增高各種肝病病人：血清AST的升高4．連續(xù)監(jiān)測法測定AST（１）原理：

采用酶偶聯(lián)反應(yīng),即L-門冬氨酸和α-酮戊二酸在AST作用下，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶作用下生成L-蘋果酸，同時(shí)伴有NADH轉(zhuǎn)化為NAD+，在340nm監(jiān)測NADH的轉(zhuǎn)化速率，從而計(jì)算出AST的活性。

雙試劑法

:同ＡＬＴ測定。（２）方法評價(jià)

誤差可來自內(nèi)源性和(或)外源性內(nèi)源性干擾主要來自血清中高濃度丙酮酸和L-谷氨酸脫氫酶(GLDH)。外源性干擾來自試劑中污染的GLDH和AST。

【參考范圍】

5～40IU/L(連續(xù)監(jiān)測法測定)

【臨床意義】

見賴氏法(二)ALP測定化學(xué)法連續(xù)監(jiān)測法：鮑氏法金氏法皮氏法１、金氏法測定ALP（１）原理：

ALP在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解釋放出酚和磷酸。酚在堿性溶液中與4－氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成紅色醌類化合物，根據(jù)紅色深淺確定ALP的活力。(2)方法評價(jià)：

磷酸苯二鈉比色法與更早的β-甘油磷酸鈉法相比具有較大的優(yōu)點(diǎn)，如水解速度快，保溫時(shí)間較短、靈敏度較高、顯色穩(wěn)定、不需去蛋白、操作簡單、快速。但與磷酸對硝基酚連續(xù)監(jiān)測法相比，準(zhǔn)確度、精密度較低；操作比較繁瑣,，靈敏度低?！緟⒖挤秶砍扇耍?～13單位，兒童：5～28單位

ALP金氏單位定義是100ml血清，37℃與底物保溫15分鐘，產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)金氏單位。ALP主要用于診斷肝膽和骨骼疾病【臨床意義】2.連續(xù)監(jiān)測法測定ALP（１）原理：以磷酸對硝基酚(p-nitrophenylphosphate,4-NPP)為底物，2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇（2-amino-2-methyl-1-propanol,AMP）或二乙醇胺為磷酸基的受體。在堿性環(huán)境下，ALP催化4-NPP水解產(chǎn)生游離的對硝基酚，對硝基酚(p-nitrophenol，4-NP)在堿性溶液中轉(zhuǎn)變成黃色。根據(jù)405nm處吸光度增高速率來計(jì)算ALP活性單位。（１）方法評價(jià)：線性范圍可達(dá)500U/L，批內(nèi)CV為2.06%～2.36%，批間CV為2.74%?！緟⒖挤秶磕行裕?～12歲<500U/L,女性：1～12歲<500U/L

12～15歲<750U/L，>15歲40～150U/L，

>25歲40～150U/L。【臨床意義】

見金氏法(三)GGT測定法化學(xué)法（重氮反應(yīng)比色法）和連續(xù)監(jiān)測法。1.重氮反應(yīng)比色法測定GGT原理：

【參考范圍】男性3～17U/L；女性2～13U/L2.連續(xù)監(jiān)測法測定GGT(1)原理：

(2)方法評價(jià)：

(2)方法評價(jià)：重氮比色法活性單位：100ml血清在37℃下反應(yīng)1hr,生成0.5μmol的α-苯胺為1個(gè)GGT活性單位。男性：11～50U/L；(以γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺為底物)女性：7～32U/L

男性：≤40U/L；女性：≤30U/L(以γ-谷氨酰-4-硝基苯胺為底物)【參考范圍】(四)MAO測定原理:

MAO主要作用于CH2-NH2基團(tuán)，在氧參與下，氧化脫氨生成相應(yīng)的卞醛、氨及過氧化氫。以芐氨偶氮-β-萘酚為底物,在O2和H20參與下，MAO催化生成芐醛偶氮-β-萘酚、氨及過氧化氫，用環(huán)己烷抽提后進(jìn)行比色測定。(2)方法評價(jià)：【單位定義】：

1ml血清與底物在37℃孵育60分鐘，催化單胺氧化產(chǎn)生1nmol芐醛偶氮-β-萘酚為1個(gè)MAO單位。【參考范圍】12～40U/ml(12×103～40×103U/L)?！九R床意義】：肝硬化時(shí)，肝纖維化現(xiàn)象十分活躍，MAO活性明顯升高。

血清膽紅素測定重氮鹽法膽紅素氧化酶(bilirubin

oxidase,BOD)法高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)、導(dǎo)數(shù)分光光度法直接分光光度計(jì)法測定方法1．重氮鹽改良J-G(JendrassikandGrof

method,J-G)法(1)原理:血清中結(jié)合膽紅素與重氮鹽反應(yīng)生成偶氮膽紅素；同樣條件下，游離膽紅素需要在加速劑作用下，使游離膽紅素分子內(nèi)的次級鍵斷裂，極性上升并與重氮試劑反應(yīng)。反應(yīng)完成后加入終止試劑，繼而加入堿性酒石酸鉀鈉使紫色偶氮試劑轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，波長600nm下比色分析，求出血樣中總膽紅素的含量。(2)方法評價(jià)：推薦的常規(guī)方法，其方法的線性范圍較寬，在342μmol/L(200mg/L)濃度下有較好的準(zhǔn)確性和精確性，高濃度時(shí)準(zhǔn)確性和精確性降低。因此，建議濃度過高時(shí)減少血樣用量測定。【臨床意義】【參考范圍】

黃疸的鑒別診斷總膽紅素:5.1～19.0μmol/L(0.3～1.1mg/dL)直接膽紅素:1.71～6.8μmol/L(0.1～0.4mg/dL)2．膽紅素BOD測定法(1)原理:BOD在不同pH條件下催化不同組份的膽紅素氧化生成膽綠素，膽綠素與氧進(jìn)行非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榈仙衔铮懠t素的最大吸收峰在450nm

附近。隨著膽紅素被氧化,450nm下降，下降程度與膽紅素濃度成正比。；在pH8.0條件下,未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，用于測定總膽紅素,在pH=4.5的酸性條件下，BOD僅能催化結(jié)合膽紅素和大部分δ膽紅素，而游離膽紅素不被氧化，測定其含量代表結(jié)合膽紅素。(2)方法評價(jià)：BOD法測定總膽紅素的準(zhǔn)確性、精密度比改良J-G法好【參考范圍】血清總膽紅素：10.26±4.10μmol/L血清結(jié)合膽紅素：2.57±2.56μmol/L膽紅素μmol/L=膽紅素mg/LX17.1【臨床意義】見重氮比色法四、血清膽汁酸測定高效液相色譜法放射免疫分析法酶免疫分析法比色分析測定法測定方法(1)酶比色法測定原理3α-HSD膽汁酸+NAD+3-氧-5β類固醇+NADH（1）

NADH+NBT甲jie（藍(lán)色化合物λ=540nm）（2）

3-氧-5β類固醇+NAD+3-氧-5β類固醇+NADH（3）黃遞酶△4-DH酶比色法由于膽汁酸在血中含量低，方法檢測的靈敏度達(dá)不到要求，通過增加3-氧-5β-類固醇脫氫酶(△4-DH)，膽汁酸經(jīng)3α-HSD催化的產(chǎn)物3-氧代膽酸在△4-DH作用下再次脫氫，加大了NADH的生成量，提高了反應(yīng)的檢測能力（見反應(yīng)式1、2、3）。但以上兩種方法都存在一個(gè)缺點(diǎn)：生成的藍(lán)色產(chǎn)物是一種染料，易于附著管壁，難于清洗或堵塞管道。酶循環(huán)法測定原理為：NAD+

Thio-NADThio-NADH膽汁酸3-氧代膽汁酸NADH3α-HSD(2)酶比色測定法評價(jià)：快速、簡便、準(zhǔn)確、可靠和適用的優(yōu)點(diǎn)。它即可以手工操作、也可以在自動(dòng)化儀器上進(jìn)行。但試劑價(jià)貴、不易保持。對酶量的要求嚴(yán)格，以保證酶