酶的非水相催化

酶的非水相催化第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二酶的非水相催化主要包括以下幾種

一、有機介質(zhì)中的酶催化二、氣象介質(zhì)中的酶催化三、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化四、離子液介質(zhì)中的酶催化

第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二一、有機介質(zhì)中的酶催化

有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物或者其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以具有催化功能。酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性和熱穩(wěn)定性等都有所改變。第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二二、氣相介質(zhì)中的酶催化

氣相介質(zhì)中的酶催化是指酶在氣相介質(zhì)中進行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。由于氣體介質(zhì)的密度低，擴散容易，所以酶在氣象介質(zhì)中的酶催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二三、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化

超臨界流體介質(zhì)中的酶催化是指在超臨界流體中進行的催化反應(yīng)。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點的流體。對應(yīng)用于酶催化反應(yīng)的超臨界流體的要求：應(yīng)當(dāng)對酶的結(jié)構(gòu)沒有破壞作用;對催化作用沒有明顯的不良影響；具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對設(shè)備沒有腐蝕性；超臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫附近或在酶催化的最適溫度附近；超臨界壓力不能太高，可節(jié)約壓縮動力費用；超臨界流體要容易獲得，價格也要便宜。

第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二四、離子液介質(zhì)中的酶催化

離子液介質(zhì)中的酶催化是指酶在離子液中進行的催化作用。離子液是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的在溫室條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇型等顯著特點。

第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二1984年，克里巴諾夫（klibanov）產(chǎn)物是:酯類、肽類、手性醇等有機化合物結(jié)論:酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應(yīng)；也可以在水和有機溶劑組成的雙液相體系中進行催化反應(yīng)；還可以在只含有微量水的有機介質(zhì)（microaqueousmedia,又稱為微水介質(zhì)）中進行催化反應(yīng)。

第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二此后，人們對有機介質(zhì)中酶的催化作用進行了許多研究，表明酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等水解酶，過氧化氫酶、過氧化物酶、醇脫氫酶、膽固醇氧化酶、多酚氧化酶、細胞色素氧化酶等氧化還原酶以及醛縮酶等轉(zhuǎn)移酶中的十幾種酶都可以在適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑介質(zhì)中起催化作用。而且酶在有機介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比水溶液中顯著提高。

第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)有機介質(zhì)中水和有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影響

第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二有機介質(zhì)反應(yīng)體系包括:

（一）微水介質(zhì)體系

（二）與水溶性有機溶劑組成的均一體系（三）與水不溶性有機溶劑組成的兩項或多項體系（四）（正）膠束體系（五）反膠束體系

第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（一）微水介質(zhì)體系

微水介質(zhì)體系是由有機溶劑和微量的水組成的反應(yīng)體系，是在有機介質(zhì)酶催化中廣泛應(yīng)用的一種反應(yīng)體系。微量的水主要是酶分子的結(jié)合水,另外有一部分水分配在有機溶劑中。由于酶分子不能溶解于疏水有機溶劑，所以酶以凍干粉或固定化酶的形式懸浮于有機介質(zhì)中，在懸浮狀態(tài)下進行催化反應(yīng)。通常所說的有機介質(zhì)反應(yīng)體系主要是指微水介質(zhì)體系。

第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（二）與水溶性有機溶劑組成的均一體系

這種均一體系是由水和極性較大的有機溶劑互相混合組成的反應(yīng)體系。酶和反應(yīng)底物都是以溶解狀態(tài)存在均一體系中。能在該反應(yīng)體系的進行催化反應(yīng)的酶較少。然而該體系近幾年來卻受到人們的極大關(guān)注這是因為辣根過氧化物酶(HRP)可以在此均一體系中催化酚類或芳香胺類低物聚合生成聚酚或聚胺類物質(zhì)。這些聚酚，聚胺類物質(zhì)在環(huán)保黏合劑，導(dǎo)電聚合物和發(fā)光聚合物等功能材料的研究開發(fā)方面的應(yīng)用引起了人們極大的興趣。第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（三）與水不溶性有機溶劑組成的兩項或多項體系

這種體系是由水和疏水性較強的有機溶劑組成的兩項或多相反應(yīng)體系。游離酶親水性底物或產(chǎn)物溶解于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶解于有機溶劑相。如果采用固定化酶，則以懸浮形式存在兩相的界面。催化反應(yīng)通常在兩相的界面進行。一般適用于底物和產(chǎn)物兩者或其中一種是屬于疏水化合物的催化反應(yīng)。

第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（四）（正）膠束體系

膠束又稱為正膠束或正膠團，是在大量的水溶液中含有少量與水不相混溶的有機溶劑，加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，有機溶劑包在液滴內(nèi)部。反應(yīng)時酶在膠束外面的水溶液中，疏水性的底物和產(chǎn)物在膠束內(nèi)部，反應(yīng)在膠束的兩相界面中進行。

第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（五）反膠束體系

反膠束又稱為反膠體團，是指在大量與水不相混溶的有機溶劑中，含有少量的水溶液，加入表面活性劑后形成的油包水的微小液滴。表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，水溶液包在膠束內(nèi)部。反應(yīng)時酶分子在反膠束內(nèi)部的水溶液，疏水性底物或產(chǎn)物在反膠束外部，催化反應(yīng)在兩相的界面中進行。在反膠束體系中，由于酶分子處于反膠束內(nèi)部的水溶液中，穩(wěn)定性好。反膠束與生物膜有相似之處，適用于生物膜表面或與膜結(jié)合的酶的結(jié)構(gòu)，催化特性和動力學(xué)性質(zhì)的研究。

第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二二、水對有機介質(zhì)中酶催化的影響

（一）水對酶分子空間構(gòu)象的影響

（二）水對酶催化反應(yīng)速率的影響

（三）水活度

第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（一）水對酶分子空間構(gòu)象的影響

酶分子需要一層水化層；維持酶分子的完整的空間構(gòu)象所必需最低水量稱為必需水；必需水與酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切關(guān)系。不同的酶，所需求的必需水的量差別很大。例如，每分子凝乳蛋白酶只需50分子水，就可以維持其空間構(gòu)象而進行正常的催化反應(yīng)；而每分子氧化酶卻需3500個水分子，才能顯示其催化活性。

必需水是維持酶分子結(jié)構(gòu)中氫鍵、鹽鍵等鍵所必需的，而氫鍵和鹽鍵又是酶空間結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要因素。第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（二）水對酶催化反應(yīng)速率的影響

有機介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。例如，馬肝醇脫氫酶在水含量較低的情況下，酶的催化反應(yīng)速度隨水含量的增加而升高。在催化反應(yīng)速度達到最大時的水含量稱為最適水含量。由于加進有機介質(zhì)反應(yīng)體系中的水，可以分布在酶分子、有機溶劑、固定化酶的載體或修飾酶的修飾劑等之中。因此，即使采用相同的酶，反應(yīng)體系的最適水含量也會隨著有機溶劑的種類、固定化載體特性、修飾劑的種類等的變化而有差別。在實際應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)根據(jù)實際情況，通過實驗確定最適水含量。

第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（三）水活度

一類是結(jié)合水，另一類是游離水。

在有機介質(zhì)體系中，結(jié)合水是影響酶催化活性的關(guān)鍵因素。水活度是指體系中水的逸度與純水逸度之比，通?？梢杂皿w系中水的蒸汽壓與同條件下純水蒸氣壓之比表示，如式:aw=rwXwXw——水的摩爾比；

rw——活度系數(shù)。第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二研究表明，在一般情況下，最適水含量隨著溶劑極性的增加而增加。而最佳水活度與溶劑的極性大小無關(guān)。所以采用水活度作為參數(shù)來研究有機介質(zhì)中水對酶催化作用的影響更為確切。不同的酶有不同的最佳水活度，在實際應(yīng)用時要根據(jù)具體情況，通過實驗得出最佳水活度。

第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二三、有機溶劑對有機介質(zhì)中酶催化的影響

有機溶劑是有機介質(zhì)反應(yīng)體系中的主要成分之一。常用有機溶劑有辛烷、正己烷、苯、季丁醇、丙醇、巳酯、二氯甲烷等。在有機介質(zhì)酶催化反應(yīng)中，有機溶劑對酶的活力、酶的穩(wěn)定性、酶的催化特性及酶催化速度等都有顯著影響。

第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（一）有機溶劑對酶結(jié)構(gòu)與功能的影響

有些酶在有機溶劑作用下，其空間結(jié)構(gòu)會受到某些破壞，從而使酶的催化活性受到影響甚至變性失活。例如，堿性磷酸酶凍干粉懸浮于乙腈中，22h,60％以上的酶不可逆的變性失活；懸浮于丙酮中36h，75％以上的酶呈現(xiàn)不可逆的失活等。酶分子在冷凍干燥的過程中，酶的活性中心構(gòu)象會受到破壞，所以應(yīng)當(dāng)加進蔗糖、甘露醇等冷凍干燥保護劑。有些酶，如脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，在有機溶劑中其整體結(jié)構(gòu)和活性中心基本上保持完整，能在適當(dāng)?shù)挠袡C介質(zhì)中進行催化反應(yīng)，然而也可能對酶的表面結(jié)構(gòu)和活性中心產(chǎn)生影響。

第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二1、有機溶劑對酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響

酶在有機介質(zhì)中與有機溶劑接觸，酶分子的表面結(jié)構(gòu)將有所變化。例如，枯草桿菌蛋白酶晶體，原來有119個與酶分子結(jié)合的水分子，懸浮在乙腈中后，與酶分子結(jié)合的水分子只有99個，有12個乙腈分子結(jié)合到酶分子中，其中有4個是原來的水分子結(jié)合位點。

第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2、有機溶劑對酶活性中心結(jié)合位點的影響

當(dāng)酶懸浮于有機溶劑中，有一部分有機溶劑能滲入到酶分子的活性中心，與底物競爭活性中心的結(jié)合位點，降低底物結(jié)合能力，從而影響酶的催化活性。例如，辣根過氧化物酶在甲醇中催化時，甲醇分子可以進入酶的活性中心，與卟啉鐵配位結(jié)合；枯草桿菌蛋白酶懸浮在乙腈中，有4個乙腈分子進入酶的活性中心。此外，有機溶劑分子可以進入酶的活性中心，會降低活性中心的極性，可能降低酶與底物的結(jié)合能力。

第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（二）有機溶劑對酶的活性影響

有機溶劑會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性。有機溶劑極性的強弱可以用極性系數(shù)lgP表示。P是指溶劑在正辛烷與水兩相中的分配系數(shù)。極性系數(shù)越大，表明極性越?。环粗畼O性系數(shù)越小，則極性越強。研究表明，有機溶劑的極性越強，越容易奪取酶分子的結(jié)合水，對酶活力的影響越大。例如，正己烷能夠奪取酶分子0.5％的結(jié)合水，甲醇可以奪取酶分子結(jié)合水的60％。極性系數(shù)lgP＜2的極性溶劑一般不適于作為有機介質(zhì)酶催化的溶劑使用。第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（三）有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響

酶作用底物和反應(yīng)后生成的產(chǎn)物—必需水層；有機溶劑能改變酶分子必需水層中底物和產(chǎn)物的濃度。所以應(yīng)該選擇極性適中的有機溶劑作為介質(zhì)使用。一般選用2≤lgP≤5的有機溶劑作為有機介質(zhì)為宜。有機溶劑對不同的酶和不同的反應(yīng)有不同的影響。因此，作為催化介質(zhì)使用的有機溶劑必須通過實驗進行選擇、確定。第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)

酶在有機介質(zhì)中的催化特性

第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二一、非水介質(zhì)中酶的結(jié)構(gòu)

酶在含微量水的有機溶劑中以懸浮狀態(tài)起催化作用。第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二實驗證實了在有機相中酶能夠保持其整體結(jié)構(gòu)的完整性，有機溶劑中酶的結(jié)構(gòu)至少是酶活性部位的結(jié)構(gòu)與水溶液中的結(jié)構(gòu)是相同。第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二1、酶在有機溶劑中維持天然構(gòu)象的原因酶分子結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化很可能是主要因素。酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)（“柔性”

）。這種結(jié)構(gòu)和構(gòu)象是酶發(fā)揮催化功能所必需的“緊密”而又有“開啟”的狀態(tài)。“緊密”

-----分子內(nèi)的氫鍵；“開啟”

-----溶液中水分子與蛋白質(zhì)分子之間所形成的氫鍵使分子內(nèi)氫鍵受到一定程度的破壞，酶蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，呈一種“開啟”狀態(tài)。酶分子的“緊密”和“開啟”兩種狀態(tài)處于一種動態(tài)的平衡中，表現(xiàn)出一定的“柔性”。第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2、測定非水介質(zhì)中酶結(jié)構(gòu)的方法

FT—IR是一種測定非結(jié)晶固體酶分子二級結(jié)構(gòu)的理想方法。雙親分子增溶法此種增溶方法不同于反相膠束，酶分子所處的微環(huán)境最接近于固體酶分子懸浮于有機溶劑中的情形，酶分子在有機溶劑中是均相的，能夠?qū)@種酶—表面活性劑復(fù)合物進行光譜分析。

第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二3、反相膠束中酶活性的保持

在反相膠束中研究得比較多的是水溶性蛋白酶，包括單體酶和多聚體酶。一些膜蛋白，(如細胞色素氧化酶，肌漿網(wǎng)狀體Ca-ATP酶、亞線粒體ATP酶)，附著于生物膜表面或介于兩膜表面之間的蛋白質(zhì)(如細胞色素C、髓磷脂堿性蛋白)也在反相膠束中進行了研究。這三種類型的酶在反相膠束中是如何排列的?可用幾種模型來表示。

第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二*幾種模型(a)可溶性酶

(b)生物膜表面的酶

(c)膜整合蛋白

第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二二、非水介質(zhì)中的酶學(xué)性質(zhì)

（一）熱力學(xué)穩(wěn)定性

（二）底物特異性

（三）對映體的選擇性

（四）位置選擇性

（五）化學(xué)鍵選擇性

（六）“pH記憶”與“pH忘記”

第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（一）熱力學(xué)穩(wěn)定性

有機溶劑中酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性都比水溶液中高。豬胰脂肪酶(PPL)在苯中催化酯交換反應(yīng)時，酶活性隨溫度升高(20—70℃)而增加，而且在70℃連續(xù)反應(yīng)7次(每次96h)后酶活性仍保持60％；PPL在有機溶劑中100℃時的半衰期可達數(shù)十小時，而在水中100℃幾乎馬上失活；PPL的穩(wěn)定性取決于有機溶劑中水的濃度，1％的水濃度會使PPL的穩(wěn)定性降低到和水溶液中相同的水平。胰凝乳蛋白酶在無水辛烷中20℃放置6個月后酶活力沒有降低，而在同樣溫度下酶在水溶液中的半衰期僅有幾天。

第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（二）底物特異性

酶在有機溶劑中對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)均有嚴(yán)格的選擇性。在正己烷中催化2—辛醇與不同鏈長的脂肪酸進行酯化反應(yīng)時，該酶對短鏈脂肪酸具有較強的特異性。介質(zhì)改變時，酶的底物專一性和催化效率會發(fā)生改變。另一方面，底物在反應(yīng)介質(zhì)與酶活性中心之間分配的變化也是影響酶的底物專一性及其催化效率的因素之一，而底物和介質(zhì)的疏水性直接影響底物在兩者之間的分配。如木瓜蛋白酶催化N—芐氧羰基—甘氨酸(N—Cb2—甘氨酸)與甲醇的甲酯化反應(yīng)中，隨著溶劑疏水性的減小，底物傾向于分配在溶劑中而不是疏水的活性中心。第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（三）對映體的選擇性

酶的對映體選擇性是指酶識別外消旋化合物中某種構(gòu)象對映體的能力，這種選擇性是由兩種對映體的非對映異構(gòu)體的自由能差別造成的。有機溶劑中酶對底物的對映體選擇性由于介質(zhì)的親(疏)水性的變化而發(fā)生改變，例如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶等蛋白水解酶對于底物N—Ac-A1a—OetCl(N—乙?；彼崧纫阴?的立體選擇因子[即(kcaL／Km)l／(kcat／Km)D的比值]在有機溶劑中為10以下，而在水中為103一104數(shù)量級。

第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（四）位置選擇性

有機溶劑中的酶催化還具有位置選擇性(regioselectivity)，即酶能夠選擇性地催化底物中某個區(qū)域的基團發(fā)生反應(yīng)。Klibanov用豬胰脂肪酶在無水吡啶中催化各種脂肪酸(C2脂肪酸，C4脂肪酸，C8脂肪酸，C12脂肪酸)的三氯乙酯與單糖的酯交換反應(yīng)，實現(xiàn)了葡萄糖1位羥基的選擇性?；?。當(dāng)然不同來源的脂肪酶催化上述反應(yīng)時，選擇性酰化羥基的位置不同。

第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（五）化學(xué)鍵選擇性

化學(xué)鍵的選擇性也是非水介質(zhì)中酶催化的一個顯著特點。As—pergillusninger脂肪酶催化6—氨基—1—己醇的?；磻?yīng)時，羥基的?；冀^對優(yōu)勢，這種選擇性與傳統(tǒng)的化學(xué)催化完全相反。這樣就可以在不需基團保護的情況下合成氨基醇的酯。

第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（六）“pH記憶”與“pH忘記”

有機溶劑中的酶能夠“記憶”在凍干或丙酮沉淀前所在緩沖液中的pH狀態(tài)。稱這種現(xiàn)象為“pH記憶”。利用酶的“pH記憶”可以控制有機相中酶催化的最適pH。在微水有機溶劑中疏水性的酸或堿與它們相應(yīng)的鹽所組成的混合物，可以作為有機相緩沖液，它們以中性和離子對形式能夠充分溶于有機相，而不能進入水或其它極性溶液，這兩種存在形式的比例控制著有機相中酶的解離狀態(tài)，使酶完全“忘記”干燥前它所處的水溶液的pH，即干燥前緩沖液的pH值對微水有機溶劑中的酶活性幾乎沒有什么影響。

第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)

有機介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及控制

第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二一、有機介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的類型

1.

合成反應(yīng)2.

轉(zhuǎn)移反應(yīng)3.

醇解反應(yīng)4.

氨解反應(yīng)5.

異構(gòu)反應(yīng)6.

氧化還原反應(yīng)7.裂合反應(yīng)

第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二二、酶的選擇

要進行酶在有機介質(zhì)中的催化反應(yīng)，首先選擇好所用的酶。在酶催化反應(yīng)時通常酶所作的底物濃度遠遠高于酶的濃度，所以酶催化反應(yīng)速度隨著酶濃度的升高而升高，兩者呈正比。在有機介質(zhì)中，進行催化反應(yīng)，對酶的選擇不但看催化速度的大小，還要特別注意酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對應(yīng)體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性等。

第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二三、底物的選擇和濃度控制

底物的濃度對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響，一般來說，在底物濃度較低的情況下，酶催化反應(yīng)速率隨底物濃度的升高而怎加。當(dāng)?shù)孜镞_到一定濃度后，再增加底物濃度，反應(yīng)速度的增大幅度逐漸減小，最后趨于平衡，逐步接近最大反應(yīng)速度。酶在有機介質(zhì)中進行催化，要考慮底物在有機溶劑和必需水層的分配情況。此外，有些底物在高濃度時，會對反應(yīng)產(chǎn)生