醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)

醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)第一頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握電泳分離的蛋白質(zhì)的基本原理2.熟悉醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)第二頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、實(shí)驗(yàn)原理（一）電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù):

利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)。第三頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、實(shí)驗(yàn)原理（二）蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。血清中各主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)均低于pH7.0，在pH8.6的堿性緩沖液中，電離成負(fù)離子，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。因血清中各種蛋白質(zhì)的pI值不同，在同一pH緩沖液中帶電荷量會(huì)有不同，此外，各蛋白質(zhì)的分子大小和形狀也不一致，所以在同一電場(chǎng)中，各蛋白質(zhì)的電泳遷移率也不同。帶電荷多、分子量小者，泳動(dòng)較快，反之則慢。第四頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白分成五條主要區(qū)帶，從正極端起依次為清蛋白/白蛋白Alb，

α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白,γ-球蛋白。這些蛋白經(jīng)過(guò)染色處理，可展示出清晰的蛋白電泳圖譜。如下圖所示。二、實(shí)驗(yàn)原理（三）第五頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二由于染色時(shí)，染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比。因此可將實(shí)驗(yàn)圖片掃描后，根據(jù)每個(gè)蛋白條帶的光密度，采用軟件計(jì)算每種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。也可將各蛋白區(qū)帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫，進(jìn)行比色，測(cè)出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對(duì)含量。二、實(shí)驗(yàn)原理（四）蛋白定量：第六頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二影響電泳的因素第七頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、實(shí)驗(yàn)器材臥式電泳槽DYY-2型電泳儀第八頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二醋酸纖維薄膜（CAM,2cm×8cm）：1片/人。染色缸1個(gè)，公用。漂洗缸3個(gè)，公用。點(diǎn)樣器：公用。濾紙：公用。鑷子：公用。第九頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二

脫色搖床第十頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二

掃描儀第十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二四、實(shí)驗(yàn)試劑

巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（pH8.6，離子強(qiáng)度0.06）染色液（麗春紅S染液）漂洗液：3%（V/V）冰醋酸第十二頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二迎著光辨別醋酸纖維薄膜（CAM）的光面和毛面。在毛面的一端1.5cm處，用直尺和鉛筆輕劃一橫線，做點(diǎn)樣標(biāo)記，并用鉛筆標(biāo)號(hào)。將已經(jīng)編號(hào)、標(biāo)記的CAM膜以毛面朝下的方式浸入巴比妥緩沖液中，浸泡30min。五、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1）醋酸纖維薄膜的準(zhǔn)備第十三頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二電泳裝置由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，兩者之間有專門的連線連接。電泳槽的正負(fù)極各有一個(gè)裝緩沖液的槽，紅色為正極，黑色為負(fù)極。

電泳槽置于水平臺(tái)，兩側(cè)注入等量的巴比妥緩沖液，使其在同一水平面。用雙層紗布搭橋。2）電泳裝置的準(zhǔn)備第十四頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1）用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在桌子上（毛面朝上）。2）在一次性手套上滴一滴血清（3-5μl），用點(diǎn)樣器在血清上蘸一下，再將點(diǎn)樣器輕印在CAM膜的點(diǎn)樣線上，待血清完全滲透到薄膜內(nèi)后移開(kāi)。2.點(diǎn)樣第十五頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二1）將加樣后的薄膜，毛面向下，垂直架于電泳槽的游桿兩端，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，紗布將膜的兩端與緩沖液連通2）將電泳槽的正極和負(fù)極分別與電泳儀的正極、負(fù)極連接，打開(kāi)電源，低壓，平衡5min。調(diào)節(jié)電壓至90-150V(110V),穩(wěn)壓電泳45min。3）待電泳區(qū)帶展開(kāi)約25-35mm后，關(guān)閉電源。3.電泳第十六頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二

電泳完畢后，取出薄膜，以毛面朝下的方式浸于麗春紅S染色液中，染色5-10min。4.染色將染色過(guò)的薄膜依次放在漂洗缸1,2,3中漂洗，每次5min5.漂洗第十七頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二

將漂洗好的CAM薄膜放置在濾紙上，吸干水分，放入掃描儀中進(jìn)行掃描，并用軟件分析各種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。6.定量各組分蛋白%=AX/AT×100%AX:各組分蛋白光密度值

AT:血清各組分蛋白光密度值之和7.計(jì)算第十八頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二

薄膜的浸潤(rùn)是電泳成敗的關(guān)鍵之一。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，但不宜太干。點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大。電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電壓，一般穩(wěn)壓在為110V。通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM，以防觸電。電泳槽緩沖液的液面要保持一定的高度，同時(shí)電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同一水平，否則，通過(guò)薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，影響蛋白分子的泳動(dòng)速度。六、注意事項(xiàng)第十九頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果第二十頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二正常參考值清蛋白 57-68%a1-球蛋白 1-5.7%a2-球蛋白 1.12-4.9%β-球蛋白 7-13%γ-球蛋白 9.8-18.2%第二十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，編輯于2023年，星期二九、臨床意義正常血清蛋白電泳一般可分為5條區(qū)帶，即Alb，α1，α2，β,γ球蛋白。1.臍帶血清、胎兒血清、部分原發(fā)性肝癌血清在Alb和α1球蛋白之間可增加一條甲胎蛋白帶。2.M蛋白血癥

單克隆γ球蛋白（M蛋白）血癥，主要見(jiàn)于多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病以及一些良性M蛋白增多癥