病毒檢驗(yàn)技術(shù)-課件

第十七章

病毒檢驗(yàn)技術(shù)1ppt課件本章內(nèi)容

第一節(jié)標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送

1第二節(jié)病毒的分離與鑒定2第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷32ppt課件學(xué)習(xí)目標(biāo)及重點(diǎn)

學(xué)習(xí)目標(biāo)：掌握病毒標(biāo)本采集和送檢應(yīng)遵循的原則；病毒檢驗(yàn)鑒定常用技術(shù)熟悉病毒血清學(xué)診斷常用的方法了解病毒感染的實(shí)驗(yàn)室快速診斷學(xué)會(huì)病毒的培養(yǎng)基本操作本章重點(diǎn)：★病毒標(biāo)本采集和運(yùn)送原則。★病毒學(xué)診斷及鑒定常用方法?！锊《九囵B(yǎng)的基本操作。3ppt課件第一節(jié)標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送

一、標(biāo)本的采集與處理1.采集時(shí)間：發(fā)病早期或急性期盡快采集。2.采集部位：取決于臨床癥狀和所懷疑感染的病毒。

如：流感病毒感染------鼻咽拭子

乙型腦炎病毒感染------腦脊液

輪狀病毒感染------糞便

乙型肝炎病毒感染------血液3.采集方法與處理

提高病毒的分離率，防止標(biāo)本污染。采集時(shí)無(wú)菌操作,可加入抗生素以殺死雜菌4ppt課件二、標(biāo)本的運(yùn)送與保存

1.標(biāo)本的運(yùn)送盡快送檢冷凍、冷藏運(yùn)輸防漏、專人、標(biāo)記2.標(biāo)本的保存-70℃可較長(zhǎng)時(shí)間保存可加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一節(jié)標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送

返回章內(nèi)容5ppt課件一、病毒的分離培養(yǎng)

2.雞胚培養(yǎng)

第二節(jié)病毒的分離與鑒定原代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞

羊膜腔接種尿囊腔接種卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種組織細(xì)胞培養(yǎng)

雞胚培養(yǎng)

動(dòng)物接種6ppt課件1.組織細(xì)胞培養(yǎng)

雞成纖維細(xì)胞Hep-2細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)瓶Vero細(xì)胞第二節(jié)病毒的分離與鑒定7ppt課件8一般選用9～14d的雞胚來(lái)源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細(xì)菌、對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體及病毒較易增殖等2.雞胚培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：第二節(jié)病毒的分離與鑒定8ppt課件選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關(guān)鍵常用的主要有：

尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種2.雞胚培養(yǎng)第二節(jié)病毒的分離與鑒定9ppt課件2.雞胚培養(yǎng)尿囊腔接種羊膜腔接種尿囊腔羊膜腔常用接種途徑：

尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng)常用于臨床流感病毒初次分離第二節(jié)病毒的分離與鑒定10ppt課件卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊絨毛尿囊膜人工氣室羊膜腔氣室絨毛尿囊膜尿囊腔

卵白2.雞胚培養(yǎng)主要用于蟲媒病毒、衣原體及立克次體的分離和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離卵黃囊第二節(jié)病毒的分離與鑒定11ppt課件3.動(dòng)物接種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等常用的接種途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式第二節(jié)病毒的分離與鑒定12ppt課件二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo)1．細(xì)胞形態(tài)的改變2．紅細(xì)胞吸附3．細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變（二）病毒數(shù)量及病毒感染性測(cè)定1．血凝試驗(yàn)2．中和試驗(yàn)3．空斑形成試驗(yàn)4．半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）

第二節(jié)病毒的分離與鑒定13ppt課件二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo)

1．細(xì)胞形態(tài)的改變（1）細(xì)胞病變效應(yīng)（cytophathiceffect，CPE）第二節(jié)病毒的分離與鑒定14ppt課件正常細(xì)胞病變細(xì)胞是指某些病毒特別是無(wú)包膜的病毒感染組織細(xì)胞后，正常生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞變圓、變性、壞死、溶解及從培養(yǎng)瓶壁脫落，細(xì)胞堆積形成葡萄狀第二節(jié)病毒的分離與鑒定15ppt課件（2）多核巨細(xì)胞1．細(xì)胞形態(tài)的改變多見(jiàn)于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染細(xì)胞融合而成多核巨細(xì)胞第二節(jié)病毒的分離與鑒定16ppt課件（3）包涵體1．細(xì)胞形態(tài)的改變

某些病毒感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一種光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆粒或尚未裝配的病毒亞基聚集而成，稱為包涵體。第二節(jié)病毒的分離與鑒定17ppt課件2．紅細(xì)胞吸附3．細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變二、病毒增殖的觀察病毒感染細(xì)胞后，可使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值改變。第二節(jié)病毒的分離與鑒定18ppt課件（二）病毒數(shù)量及病毒感染性測(cè)定二、病毒增殖的觀察1．血凝試驗(yàn)病毒顆粒紅細(xì)胞

某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，將這類病毒感染細(xì)胞后收集的病毒液作不同稀釋，以發(fā)生血凝反應(yīng)的病毒液的最高稀釋度作為該病毒的血凝效價(jià)（即滴度），可對(duì)病毒含量進(jìn)行半定量測(cè)定。血凝現(xiàn)象第二節(jié)病毒的分離與鑒定19ppt課件能使紅細(xì)胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為該病毒的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）第二節(jié)病毒的分離與鑒定20ppt課件病毒顆粒紅細(xì)胞病毒抗體

血凝抑制試驗(yàn)病毒液中若先加入病毒的特異性抗體，抗體與病毒表面的抗原特異性結(jié)合，從而抑制病毒與紅細(xì)胞的血凝現(xiàn)象，稱為血凝抑制試驗(yàn)。第二節(jié)病毒的分離與鑒定21ppt課件2．中和試驗(yàn)（Nt）

在體外孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應(yīng)，再將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后觀察CPE或紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象是否消失，即特異性抗體是否中和相應(yīng)病毒，從而測(cè)定殘存的病毒感染力的一種方法3．空斑形成試驗(yàn)第二節(jié)病毒的分離與鑒定22ppt課件4．半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）測(cè)定病毒感染雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞后，引起50%死亡或病變的最小量。用來(lái)估計(jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度，但不能準(zhǔn)確測(cè)定感染性病毒顆粒的多少返回章內(nèi)容第二節(jié)病毒的分離與鑒定23ppt課件

第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷

1.

光學(xué)顯微鏡檢查：

*直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒）

*包涵體狂犬病毒感染------嗜酸性包涵體

巨細(xì)胞病毒感染---“貓頭鷹眼”狀的嗜酸性包涵體

24ppt課件2.電子顯微鏡檢查：

*透射電子顯微鏡

用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等*掃描電子顯微鏡：

用于觀察病毒和細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等

一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷掃描電子顯微鏡

第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷25ppt課件H1N1流感病毒電子顯微鏡圖片狂犬病病毒電子顯微鏡圖片

第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷26ppt課件（1）標(biāo)本制備①超濾法②超速離心法③接種細(xì)胞快速增殖法④免疫凝集法（2）常用觀察方法

①負(fù)染色法②超薄切片法③免疫電鏡法病毒顆粒具有亮度，在周圍較暗的背景上顯示亮點(diǎn)過(guò)程與病理切片過(guò)程相似免疫組織化學(xué)與電鏡技術(shù)的結(jié)合透射電子顯微鏡

第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷27ppt課件二、血清學(xué)檢測(cè)及診斷

原理：用已知的病毒抗原檢測(cè)患者血清中的抗體水平或

用已知的病毒抗體直接檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原1.病毒抗原的檢測(cè)：用熒光素、酶或膠體金等標(biāo)記物標(biāo)記病毒抗體檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)病毒抗原。如ELISA檢測(cè)HBsAg

第三節(jié)病毒學(xué)檢測(cè)及診斷28ppt課件2.病毒抗體的檢測(cè)：已知病毒抗原多數(shù)為通過(guò)基因工程技術(shù)制備的重組抗原，其次是從患者標(biāo)本中分離純化的抗原。檢測(cè)抗體的類型確定患者所處感染階段-----急性期單份血清的IgM測(cè)定是診斷原發(fā)感染和早期感染-----IgG含量的測(cè)定應(yīng)取病人急性期和恢復(fù)期雙份血清，若含量