分子診斷策略與常用技術(shù)

第十二章

分子診斷

一、分子診斷的概念和特點概念：

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，通過檢測基因結(jié)構(gòu)或其表達水平是否正常，從而對人體健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型→基因型基因診斷：基因型→表現(xiàn)型（逆向診斷）特點特異性強靈敏度高早期診斷性適應(yīng)性強一、分子診斷的概念和特點檢測致病基因突變；分析與疾病連鎖的遺傳標志；建立多基因疾病表型克??；定量分析致病基因的表達水平已明確疾病表型與基因型的關(guān)系分子診斷的前提二、分子診斷策略直接診斷——直接檢測致病基因的突變基因突變類型—缺失、點突變、重復(fù)、插入等間接診斷——應(yīng)用DNA多態(tài)性為遺傳標記進行連鎖分析，確定待測者是否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷

DNA多態(tài)——RFLP、VNTR、SNP4DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）群體中每個個體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如STR其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR，為第二代多態(tài)性標記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代，為第三代多態(tài)性標記。二、分子診斷策略三、分子診斷常用技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)DNA限制性長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析PCR-SSCPDNA測序DNA芯片技術(shù)

點突變（CtoT）5’3’3’5’G5’3’引物1引物2探針1探針2A等位基因特異寡核苷酸探針（ASO）

原理指DNA序列上發(fā)生一個變異后獲得或丟失了一限制性識別位點，使DNA限制性片段長度發(fā)生變化，在人群中形成兩種或兩種以上的限制性類型

利用特定限制性識別位點進行基因分析限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）RLFP分析法RFLP分析優(yōu)點分辯率高，無需標記,重復(fù)性好，簡便快速直觀主要用于核酸變異分析比較,微生物的分群分型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。局限只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點改變篩選，檢測效率低。

原理將經(jīng)擴增的DNA片段變性形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標準物的對比，即可檢測出有無變異。

優(yōu)點檢測基因變異，具有操作簡便、快速特點，不需特殊設(shè)備，適用于大樣本篩選。

己廣泛應(yīng)用于檢測各種病原體基因的點突變及缺失突變，基因的多態(tài)性分析等。PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）（PCR-SSCP）示意圖DNA測序DNA自動測序結(jié)果舉例DNA芯片技術(shù)四、分子診斷的應(yīng)用及舉例遺傳疾病腫瘤感染性疾病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定×MstⅡ酶切位點(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析GAG→GTG

↓谷Aa→纈Aa+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析

NormalβΑGeneProbe——與正常ProbeβΑ雜交穩(wěn)定

MutationβSGeneProbe——與異常

βS雜交穩(wěn)定

鐮狀紅細胞貧血患者基因組的ASO探針雜交斑點雜交結(jié)果：鐮狀紅細胞貧血患者基因組的ASO探針雜交βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS正常探針異常探針20正常人純合突變雜合突變Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣《化妝品術(shù)語》起草情況匯報中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所一、標準的立項和下達時間2006年衛(wèi)生部政法司要求各標委會都要建立自己的術(shù)語標準。1ONE二、標準經(jīng)費標準研制經(jīng)費：3.8萬三、標準的立項意義術(shù)語標準有利于行業(yè)間技術(shù)交流、提高標準一致性、消除貿(mào)易誤差，作為標準體系中的基礎(chǔ)標準，術(shù)語標準在各個領(lǐng)域的標準體系中均起著重要的作用。隨著我國化妝品衛(wèi)生標準體系建設(shè)逐步加快，所涉及的術(shù)語和定義的數(shù)量也在迅速增長，在此情形下，化妝品術(shù)語標準的制定就顯得尤為重要。四、標準的制訂原則1.合法性遵守《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實施細則》中關(guān)于化妝品的定義。2.協(xié)調(diào)性直接引用或修改采用的方式，與相關(guān)標準中的術(shù)語和定義相協(xié)調(diào)。3.科學(xué)性對于沒有國標或定義不統(tǒng)一的術(shù)語，在定義時體現(xiàn)科學(xué)性的原則。4.實用性在標準體系中出現(xiàn)頻率較高，與行業(yè)聯(lián)系較緊密的術(shù)語優(yōu)先選用。五、標準的起草經(jīng)過

第一階段：資料搜集

搜集國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)、標準、文獻并對國外文獻如美國21CFR進行翻譯。第二階段：2007年末形成初稿

初稿內(nèi)容包括一般術(shù)語、衛(wèi)生化學(xué)術(shù)語、毒理學(xué)術(shù)語、微生物術(shù)語、產(chǎn)品術(shù)語、人體安全和功效評價術(shù)語，常用英文成份術(shù)語等７部分。第三階段：專家統(tǒng)稿1.2007年12月第一次專家統(tǒng)稿會（修訂情況：1.在結(jié)構(gòu)上增加原料功能術(shù)語、相關(guān)國際組織和科研機構(gòu)等內(nèi)容；2.在內(nèi)容上增加一般術(shù)語、產(chǎn)品術(shù)語的種類，將化妝品行業(yè)的新產(chǎn)品類別納入本標準；3.對于毒理學(xué)、衛(wèi)生化學(xué)、微生物學(xué)術(shù)語進行修改；4.刪除與化妝品聯(lián)系不緊密、無存在必要的常用英文成分術(shù)語。2.2009年1月第二次專家統(tǒng)稿會會議意見：1.修改能引用國家標準的盡量引用國家標準；對存在歧義的個別用詞進行修改。2.刪除由于本標準中的“產(chǎn)品術(shù)語”一章和香化協(xié)會所制定的某個標準存在重復(fù)，因此刪除“產(chǎn)品術(shù)語”一章的內(nèi)容；對“原料功能術(shù)語”的內(nèi)容進行梳理，刪除了20余條內(nèi)容。3.增加專家建議增加“化妝品限用物質(zhì)”等若干項術(shù)語。第四階段：征求意見2009年2月面向全國公開征求意見。第五階段：征求意見的處理與形成送審稿。在征求意見的處理階段再次征求了相關(guān)專家的意見。六、標準的內(nèi)容依據(jù)1.《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實施細則》;2.《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》;3.美國21CFR；4.相關(guān)領(lǐng)域國家標準如：GB5296.3-2008消費品使用說明化妝品通用標簽，GB/T14666-2003分析化學(xué)術(shù)語等；5.國內(nèi)外化妝品的相關(guān)文獻，如《化妝品監(jiān)督管理及安全性評價》等。七、標準的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容（一）結(jié)構(gòu)：1.范圍2.一般術(shù)語3.毒理學(xué)試驗方法術(shù)語4.衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法術(shù)語5.微生物檢驗方法術(shù)語6.人體安全性和功效性評價術(shù)語7.常用原料術(shù)語8.縮寫9.中英文索引（二）主要內(nèi)容：1).一般術(shù)語39條涉及化妝品的基本定義、化妝品生產(chǎn)和監(jiān)督管理中出現(xiàn)頻率較高的術(shù)語。2).毒理學(xué)試驗方法術(shù)語40條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中涉及的術(shù)語，以及在毒理學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)頻率較高、與化妝品毒理學(xué)試驗方法聯(lián)系較密切的術(shù)語。3).衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法術(shù)語22條收錄了化妝品的衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法中較常用的術(shù)語。

4).微生物檢驗方法術(shù)語6條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中所涉及的術(shù)語。5).人體安全性和功效性評價術(shù)語38條收錄了人體安全性和功效性評價的常用術(shù)語。6).常用原料術(shù)語55條收錄了常用原料術(shù)語，與《化妝品管理及安全性和功效性評價》保持一致，并根據(jù)企業(yè)、專家的意見進行了適當修改。7).縮寫涉及國際機構(gòu)縮寫以及化妝品毒理學(xué)、化學(xué)、人體安全性和功效評價等領(lǐng)域?qū)I(yè)術(shù)語的縮寫34條。七、征求意見處理情況2009年2月20日，《化妝品術(shù)語》在全國公開范圍內(nèi)公開征求意見，截止到2009年3月末共收到來自企業(yè)、和社會各界的意見和建議共146條，分布情況如下：征求意見來源統(tǒng)計圖二一般術(shù)語三毒理學(xué)四化學(xué)五微生物六人體七原料八縮寫各部分征求意見采納情況統(tǒng)計圖二一般術(shù)語三毒理學(xué)四化學(xué)五微生物六人體七原料八縮