傳染病實驗8豬瘟臨床診斷

實驗八 豬瘟的診斷方法與技術一、豬瘟的診斷方法臨床癥狀、流行病學診斷：臨床癥狀：體溫升高、結膜發(fā)炎、先便秘后腹瀉、母豬流產、死胎、白細胞減少。流行病學：病毒來源、傳播方式。急性以出血性敗血癥，慢性以纖維素性壞死性腸炎為其特征。病理學診斷：淋巴結：大理石樣外觀。腎臟：點狀出血，“麻雀卵樣腎”。膀胱、喉頭：出血。腸：扣狀潰瘍。脾臟：邊緣梗死。盈淋巴結出血（大理石樣）。腎臟表面出血。脾臟梗死：是最有診斷意義的病理變化。腸漿膜出血?；孛ぐ昕蹱顫儭：眍^出血。膀胱黏膜出血。病原學診斷：病毒分離鑒定：細胞培養(yǎng)法：豬腎、睪丸細胞培養(yǎng)，無細胞病變，用熒光抗體法檢測細胞漿內的病毒抗原。新城疫病毒強化法：先接病料，再接新城疫病毒，如出現(xiàn)細胞病變則為陽性，反之為陰性。豬瘟病毒感染細胞熒光染色試驗組：病料接種豬。對照組：抗血清對豬被動免疫，再接種病料（6~24小時）。飼養(yǎng)觀察21天，如試驗組發(fā)病，對照組不發(fā)病確診。動物回歸試驗兔體交互免疫試驗1.試驗原理：強毒不引起家兔體溫反應，但能使其產生免疫力，而兔化弱毒能使家兔產生定型熱反應，但對已產生免疫力的家兔則不產生體溫反應。試驗方法：將病豬的病料用抗菌素處理后，接種家兔并每6小時測溫一次，連續(xù)測3天，同時設注射生理鹽水的對照兔。7天后對所有家兔靜脈注射HC兔化弱毒，同樣每6小時測溫一次，連續(xù)測溫3天。如試驗對照免發(fā)生定型熱反應，說明試驗成立，可以分析判定結果。兔體交互免疫試驗注射病料后發(fā)熱反應注射弱毒疫苗后發(fā)熱反應結果判定無無豬瘟強毒有無有無弱毒有其它致熱源兔體交互免疫試驗結果判定血清學診斷方法：中和試驗ELISA間接血凝試驗分子生物學方法：RT-PCR熒光定量PCR核酸雜交等。豬瘟的診斷方法豬瘟的間接血凝試驗一、實驗目的

二、實驗原理

三、主要器材

四、方法和步驟五、結果判定與分析六、思考題一、實驗目的

掌握豬瘟病毒間接血凝試驗的原理、操作方法和結果判定方法。了解豬瘟的常用診斷方法和技術。二、實驗原理將可溶性抗原（豬瘟病毒）吸附于與免疫無關的紅細胞表面，制成診斷試劑。致敏的紅細胞與相應抗體相遇時，就會發(fā)生特異性結合，經(jīng)過一定時間的相互作用就會出現(xiàn)肉眼可見的紅細胞凝集現(xiàn)象。載體最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細胞及人紅細胞。致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3d。為此一般在致敏前先將紅細胞醛化，可長期保存而不溶血。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質抗原或抗體的能力。如用兩種不同醛類處理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸處理。致敏致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。致敏蛋白質（抗原或抗體）在低pH，低離子濃度下，用醛化紅細胞直接吸附即可。間接法則需用耦聯(lián)劑將蛋白質結合到紅細胞上。常用耦聯(lián)劑為雙耦氮聯(lián)苯胺(bis-diazotized

benzidine，BDB)和氯化鉻。前者通過共價鍵，后者通過金屬陽離子靜電作用使蛋白質與紅細胞表面結合而達到致敏目的新鮮紅血球：新鮮紅血球用阿氏液保存于4℃，可供3周內使用。采用新鮮紅血球做凝集反應，模型新鮮，典型。但用新鮮紅血球致敏后，保存時間短。為了克服這一缺點，多采用醛化紅血球或鞣化紅血球。戊二醛醛化過程：①取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質；②以0.15Mol/L

pH

7.2PBS配成1%戊二醛溶液，4℃保存?zhèn)溆茫虎蹖?00ml1%冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml紅血球中，邊加邊攪拌（也可置電磁攪拌器上）30min；④離心去上清，以生理鹽水洗滌4次，最后以PBS液（或生理鹽水）配成10%懸液，加1/萬硫柳汞，4℃保存。＋間接血凝試驗原理示意圖＋抗原致敏的方法致敏：將抗原（或抗體）結合或吸附于紅細胞表面。方法：制備紅細胞懸液：健康公綿羊血。紅細胞醛化：戊二醛（甲醛、丙酮醛）。鞣酸化：鞣酸（單寧酸）。致敏。三、主要器材血凝板（2人/塊）豬瘟病毒陽性血清豬瘟病毒陰性血清被檢血清醛化紅細胞懸液稀釋液移液器槍頭四、間接血凝試驗操作方法孔號123……89101112稀釋倍數(shù)2×4×8×……256×512×陽性對照陰性對照紅細胞對照稀釋液505050……5050棄5050血清505050……50505050紅細胞505050……5050505050結果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋……＋

＋-＋＋＋＋--五、結果判定標準

＋＋＋＋：紅細胞呈細沙樣均勻鋪于孔底，即100%凝集。

＋＋＋：紅細胞均勻鋪于孔底，但邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75%凝集。

＋＋：紅細胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊，即50%凝集。＋：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，即25%凝集。－：紅細胞于孔底形成圓團，邊緣光滑整齊，即無凝集。不同程度凝集強度示意圖孔號123456789稀釋倍數(shù)2×4×8×16×32×64×128×256×512×結果＋＋＋＋＋＋＋＋＋