血凝及血凝抑制實驗

實驗二

血凝及血凝抑制實驗

當(dāng)前第1頁\共有24頁\編于星期日\15點實驗?zāi)康?/p>

１血凝試驗：滴定病毒的血凝效價(病毒的凝集價)，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位。２血凝抑制試驗：應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒液測定血清中的相應(yīng)抗體或應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒．３檢測實驗用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。４掌握基本操作技術(shù),了解其實用價值．

當(dāng)前第2頁\共有24頁\編于星期日\15點實驗原理

當(dāng)前第3頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝素（HA）柱狀流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖當(dāng)前第4頁\共有24頁\編于星期日\15點刺突：亞型特異性抗原，易變異

血凝素（HA，從H1—H15):呈柱狀

功能：①吸附細(xì)胞：與細(xì)胞上受體結(jié)合,使病毒侵入細(xì)胞②凝集多種動物的紅細(xì)胞（血凝試驗）③具抗原性：其抗體能中和病毒---中和抗體抑制血凝（血凝抑制試驗）當(dāng)前第5頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝試驗原理血凝素（hemagglutininHA）：由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒吸附和傳入宿主細(xì)胞有關(guān)。HA能與人或其它動物多種紅細(xì)胞表面N－乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集。為病毒的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)或血凝反應(yīng)。當(dāng)前第6頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝原理血凝抑制原理當(dāng)前第7頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝抑制試驗原理

病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，即抗體與病毒結(jié)合后，血凝素?zé)o法吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，用免疫血清阻止紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象，稱為血凝抑制．

當(dāng)前第8頁\共有24頁\編于星期日\15點實驗材料器材：U型或V型微量反應(yīng)板、微量移液器、槍頭試劑：1%雞紅細(xì)胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理鹽水當(dāng)前第9頁\共有24頁\編于星期日\15點實驗步驟1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水2.在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。當(dāng)前第10頁\共有24頁\編于星期日\15點當(dāng)前第11頁\共有24頁\編于星期日\15點3.在1-12孔均加入25ul的生理鹽水。4.在每孔內(nèi)加入25ul1%的雞紅細(xì)胞懸液，震蕩，室溫靜止感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5.計算血凝效價，稀釋使成為四價備用．當(dāng)前第12頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝試驗結(jié)果判定效價判定：凝集特別顯著：“＋＋＋＋”凝集現(xiàn)象次之：“＋＋＋”凝集清楚可見：“＋＋”稍顯凝集者：“＋”血凝效價：呈“＋＋”凝集時的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。當(dāng)前第13頁\共有24頁\編于星期日\15點結(jié)果判定1.在各組對照均正確的情況下，按下列標(biāo)準(zhǔn)判定

血凝反應(yīng)強度示意圖“4＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮?！?＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”。“2＋”紅細(xì)胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀?！埃奔t細(xì)胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒?！埃奔t細(xì)胞均沉于孔底呈小圓點狀，邊緣整齊。2.對照孔正常的情況下，紅細(xì)胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價的終點。凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價。當(dāng)前第14頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝抑制1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實驗臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水。2.在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。當(dāng)前第15頁\共有24頁\編于星期日\15點當(dāng)前第16頁\共有24頁\編于星期日\15點3.在1-12孔內(nèi)均加入“四價”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用5min。4.在1-12孔內(nèi)均加入1%的雞紅細(xì)胞懸液25ul，震蕩，室溫感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5.觀測結(jié)果，記錄實驗數(shù)據(jù)．當(dāng)前第17頁\共有24頁\編于星期日\15點血凝抑制試驗結(jié)果判定測定孔RBC沉于孔底中心，呈紐扣狀。(+)

凝集（-）病毒對照孔：凝集RBC對照孔：無自凝血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度。

當(dāng)前第18頁\共有24頁\編于星期日\15點當(dāng)前第19頁\共有24頁\編于星期日\15點當(dāng)前第20頁\共有24頁\編于星期日\15點思考題1、病毒凝集紅細(xì)胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng)？為什么？2、血凝抑制實驗是不是特異的抗原抗體反應(yīng)?為什么？3、血凝試驗中為什么要加補充液？4、為什么加病毒液和紅細(xì)胞懸液時要反向加？5、血凝試驗和血凝抑制試驗中空白對照的意義？當(dāng)前第21頁\共有24頁\編于星期日\15點孔號1234567891011(+)12（-)HA稀釋度248163264128256、、、、棄生理鹽25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理鹽水2525252525252525252525251%雞紅細(xì)胞252525252525252525252525結(jié)果預(yù)測++++++++++++++++++++++++++--++++_孔號1234567891011(+)12（-)HI稀釋度248163264128256、、、、棄生理鹽25252525252525252525X25待檢血清2525252525252525252525x4HA血凝素2525252525252525252525251%雞