甲狀腺癌功能性miRNA地鑒定、臨床意義及其作用機(jī)制

甲狀腺癌功能性miRNA的鑒定、臨床意義及其作用機(jī)制開題報告人:王培松指導(dǎo)教師:陳光教授報告內(nèi)容1.背景及選題依據(jù)2.研究目的及意義3.研究內(nèi)容及關(guān)鍵問題4.研究方法5.研究條件6.研究進(jìn)度及具體安排7.本題創(chuàng)新之處8.預(yù)期結(jié)果背景及選題依據(jù)甲狀腺癌發(fā)病占甲狀腺結(jié)節(jié)的5-20%、全身腫瘤的1.5%，是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。近年許多資料顯示甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升,是近年備受關(guān)注的腫瘤之一,也是內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。2008年估計美國新發(fā)病例37340,1590人死于甲狀腺癌。由于甲狀腺癌多起病隱匿,常以無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)為最初臨床表現(xiàn),因此早期診斷較為困難。目前常用診斷方法包括觸診、超聲、核素顯像、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢等,其中細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是篩查和早期診斷甲狀腺癌的有效方法,但仍然存在一定的假陰性率和部分無法確診的病例,且需考慮患者的依從性。因此，研究鑒定早期診斷預(yù)警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題，有重要臨床意義。越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)逐步建立了腫瘤與miRNA表達(dá)變化的關(guān)聯(lián)，提示我們在不同的腫瘤中檢測特定的miRNA的表達(dá)變化很可能成為腫瘤診斷、分期和預(yù)后預(yù)測的有力工具。但甲狀腺癌中的miRNA尚知之甚少。研究目的及意義通過檢測甲狀腺良惡性腫瘤及其配對血清中miRNA的差異表達(dá)情況，分析與患者臨床病理特征及其生存情況的相關(guān)性，鑒定出與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是早期癌變密切相關(guān)的功能性miRNA。為通過檢測新型miRNA開展甲狀腺癌早期診斷及預(yù)后分級提供新途徑。研究內(nèi)容及關(guān)鍵問題1、研究候選miRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)特征與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。采用定量RT-PCR檢測3-5個候選miRNA在30例甲狀腺癌組織及癌旁正常甲狀腺組織樣本及30例良性甲狀腺疾病組織中的表達(dá)；分析這些miRNA與甲狀腺癌患者臨床病理特征及其生存情況的相關(guān)性；在此基礎(chǔ)上，從中篩選出1-3個具有重要臨床意義的miRNA。2、檢測不同臨床分期，特別是早期甲狀腺癌患者血清中的上述miRNA的表達(dá)變化規(guī)律，分析將這些miRNA作為甲狀腺癌早期診斷預(yù)警分子的精準(zhǔn)性。3、通過檢測同一患者多發(fā)灶同一miRNA的表達(dá)，探討其多灶性起源的原因。4、研究揭示具有重要臨床意義的miRNA在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是在早期癌變中的功能及其作用機(jī)制，為通過檢測新型miRNA開展甲狀腺癌早期診斷及預(yù)后分析提供新途徑。通過BrdU和克隆形成等實(shí)驗(yàn)確定miRNA是否與甲狀腺癌細(xì)胞的分裂增殖密切相關(guān)；通過細(xì)胞移動和細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)確定候選miRNA是否在甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用；最后通過定量RT-PCR和免疫印跡（westernblot）等技術(shù)手段，確定miRNA所調(diào)控的靶基因，確定作用機(jī)制。從甲狀腺癌差異表達(dá)miRNA中，篩選出有重要臨床意義者，進(jìn)一步應(yīng)用過表達(dá)與RNA抑制技術(shù)，開展miRNA功能研究，鑒定出功能性miRNA，是本項(xiàng)目的技術(shù)關(guān)鍵。為此，我們擬選取至少3種甲狀腺癌細(xì)胞（ATCcelllinesARO、FRO、KTC-2(derivedfromanaplastictransformedPTC);PTCcelllinesNPA、TPC-1;)FTCcelllineWRO）和3種永生化正常甲狀腺濾泡細(xì)胞(如HT-ori3、HEK293T等)，分別進(jìn)行miRNA過表達(dá)或miRNA抑制實(shí)驗(yàn)，從正反多方面進(jìn)行研究，可確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果確切，說明問題有力。技術(shù)路線 miR-121、miR-122、miR-197miR-121、miR-122、miR-197、miR-346、miR-17-5p和miR-19a等6個候選miRNA660例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及60例良性疾病組織（每份組織臨床資料齊整且均有其術(shù)前血清）該部分工作已完成該部分工作已完成詳見可行性分析詳見可行性分析①定量RT-PCR檢測定量RT-PCR檢測60例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及60例良性疾病組織（每份組織均有其術(shù)前血清）上述6個候選miRNA的表達(dá)量詳見可行性分析②詳見可行性分析②SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分析SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分析篩選出1篩選出1~3個與腫瘤分裂增殖、侵襲移動或不良預(yù)后相關(guān)的miRNA在甲狀腺在甲狀腺癌患者癌組織中下調(diào)的miRNA甲狀腺癌患者癌組織中上調(diào)的miRNA1）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺1）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺癌細(xì)胞（該miRNA在這些細(xì)胞中高表達(dá)），下調(diào)該miRNA的表達(dá)；2）miRNA分別轉(zhuǎn)染正常甲狀腺上皮細(xì)胞（該miRNA在這些細(xì)胞中低表達(dá)）使miRNA的表達(dá)量升高1）miRNA分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺癌細(xì)胞（該miRNA在這些細(xì)胞中低表達(dá)），上調(diào)該miRNA的表達(dá)；2）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染正常甲狀腺上皮細(xì)胞（該miRNA在這些細(xì)胞中高表達(dá)）使miRNA的表達(dá)量降低詳見可行性分析③詳見可行性分析③分析細(xì)胞移動和侵襲能力(分析細(xì)胞移動和侵襲能力(Chamber移動實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn))分析細(xì)胞分裂增殖能力（BrdU實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)）詳見可行性分析④詳見可行性分析④不同臨床分期，特別是早期甲狀腺不同臨床分期，特別是早期甲狀腺癌患者血清中上述miRNA的表達(dá)變化規(guī)律miRNA靶基因的表達(dá)（定量RT-PCR和免疫印跡）鑒定出與鑒定出與正常甲狀腺上皮癌變、早期癌變、甲狀腺癌細(xì)胞分裂增殖、移動和侵襲等腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)的功能性miRNA并鑒定其在多灶性甲狀腺癌中的表達(dá)情況研究進(jìn)度及具體安排2010年2月至2010年7月，臨床標(biāo)本資料收集整理。2010年7月至2010年10月定量RT-PCR檢測候選miRNA在30例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及30例良性疾病組織（每份組織均有其術(shù)前血清）中的表達(dá)量，并分析它們的表達(dá)與患者的臨床病理特征及其生存情況的相關(guān)性，篩選出1-3個具有潛在臨床意義的miRNA。2010年10月至2010年12月，鑒定具有潛在臨床意義的miRNA（1-3個）在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能及其作用機(jī)制。在課題實(shí)施過程中，根據(jù)課題進(jìn)展情況，隨時總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫研究論文。研究條件吉林大學(xué)第一醫(yī)院甲狀腺外科每年可完成數(shù)百例（400例以上）甲狀腺癌切除手術(shù)，本試實(shí)驗(yàn)新鮮標(biāo)本來源充足吉林大學(xué)第一醫(yī)院病歷資料系統(tǒng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理資料庫吉林大學(xué)白求恩基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化實(shí)驗(yàn)室吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科高年資醫(yī)師閱片本題創(chuàng)新之處及成果價值1.發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA類甲狀腺癌早期診斷預(yù)警分子。研究鑒定早期診斷預(yù)警分子，對甲狀腺癌早期診斷有重要臨床意義。針對這一突出臨床問題，本研究擬通過檢測甲狀腺良惡性腫瘤及其配對血清中miRNA的差異表達(dá)情況，揭示它們在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是在早期癌變中的功能及其臨床意義。在研究過程中將可能發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA類甲狀腺癌早期診斷預(yù)警分子或甲狀腺癌的腫瘤特異性標(biāo)志物，因此本項(xiàng)目的創(chuàng)新性十分明顯。2.從血清中鑒定出新型miRNA類甲狀腺癌早期診斷預(yù)警分子。miRNA在其它腫瘤患者血清中表達(dá)情況已有報道，但在甲狀腺疾病中的研究很少，本項(xiàng)目在檢測甲狀腺良惡性腫瘤中miRNA的差異表達(dá)情況同時檢測其配對血清中miRNA的差異表達(dá)情況，未來有望通過檢測血清miRNA來早期發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤。3.首次通過同一患者多發(fā)灶miRNA表達(dá)差異性情況，驗(yàn)證其多灶性起源問題。多發(fā)病灶是甲狀腺乳頭狀癌的臨床特征之一，文獻(xiàn)報道發(fā)生率為18％～87％。多發(fā)病灶具有更高的惡性特征，表現(xiàn)為頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及甲狀腺外浸潤的比例更高；多灶源于腺內(nèi)轉(zhuǎn)移還是多克隆起源目前仍有爭議。本項(xiàng)目首次通過同一患者多發(fā)灶miRNA表達(dá)差異性情況，驗(yàn)證其多灶性起源問題。4.在獲得甲狀腺癌差異表達(dá)新miRNA的基礎(chǔ)上，率先研究揭示這些miRNA分子在甲狀腺癌中的功能及其作用機(jī)制。由于研究起步較晚，迄今為止，在甲狀腺癌中，作為一類具有重要調(diào)控功能的小R