氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究

氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究【摘要】目的篩選氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株并穩(wěn)定其發(fā)酵效價。方法以黑暗鏈霉菌Ts228為出發(fā)菌株，經(jīng)自然分離，UV誘變結(jié)合耐自身代謝產(chǎn)物處理，采用瓊脂塊法并結(jié)合搖瓶發(fā)酵來篩選高產(chǎn)菌，獲得了Tt49新菌株。以搖瓶發(fā)酵考察生長特性，罐上發(fā)酵繪制代謝曲線。結(jié)果效價提高了倍，妥布霉素含量高達%。該菌株生長周期僅4d，傳代穩(wěn)定。種齡18h左右，接種量10%。按照代謝曲線圖進行調(diào)控，發(fā)酵罐的產(chǎn)抗水平達5865u/ml。結(jié)論自然分離與誘變相結(jié)合，是黑暗鏈霉菌選育的有效途徑。出發(fā)菌株經(jīng)UV誘變和耐受馴育，發(fā)酵效價顯著提高。溶氧是妥布霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的重要調(diào)控因子。

【關鍵詞】黑暗鏈霉菌；氨甲酰妥布霉素；深層發(fā)酵；抗生素

ABSTRACTObjectiveScreeningahighandstablemutantstrainfromTs228forCTB(carbamoyltobramycin)production.MethodsAparentstrain(Ts228)wasisolatedbynaturalselection,thentreatedbyUV,andculturedonplatecontainingtobramycin.Finally,ahighyieldmutantTt49wasobtainedthroughseveralcyclicscreening.Itsproductivitywasdetectedinflaskandthecurvesoftypicalfermentationwereprocessedin50Lfermenter.ResultsAmutantstrainTt49wascultured.Itsfermentationtitreincreasedto5869u/mlwhichwastimeshigherthantheparentstrainTs228,andthecomponentratiooftobramycincomesupto%.ThefermentationcourseofTt49onlyneed4days.The18hseedmyceliumand10%W/Vofinoculationwereused.ConclusionsThecombinationofnaturalselectionandUVwasausefulmethodfortobramycinfromDissolvedoxygenisanimportantparameterinfermentationcondition.

KEYWORDS;Tobramycin;Fermentation;Antibiotics

氨甲酰妥布霉素(carbamoyltobramycin)是黑暗鏈霉菌(Streptomycestenebrarius)經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的尼拉霉素復合物5′組分，經(jīng)酸或堿催化水解得到妥布霉素(tobramycin)。妥布霉素是臨床上廣泛使用的第二代氨基糖苷類抗生素，主要作用于細菌30S核糖體亞基，抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，廣泛應用于敗血癥、中樞神經(jīng)感染及新生兒的膿毒癥等［1］，總有效率達85%以上。妥布霉素與其它抗生素聯(lián)合使用，不僅可增強抗菌活性，還可擴大抗菌范圍。此外，妥布霉素對第八對腦神經(jīng)的耳毒性比新霉素、慶大霉素低。由于發(fā)酵效價不穩(wěn)定，分離純化困難，生產(chǎn)成本居高不下，銷售價格昂貴，影響其普及使用。

有關妥布霉素的研究活動一直很活躍，從生產(chǎn)菌株的改良到代謝途徑的揭示，再到合成基因簇的克隆等各方面均有。沈陽藥科大學采用紫外線和亞硝基胍結(jié)合耐受處理篩選妥布霉素產(chǎn)生菌［2，3］；丹麥科研人員利用碳標記實驗考查代謝產(chǎn)物的通量，發(fā)現(xiàn)黑暗鏈霉菌在生長階段ED途徑活躍［4］，但未闡明安普霉素、卡那霉素B和妥布霉素的分歧代謝途徑；韓國研究者于2004年從黑暗鏈霉菌ATCC17920中分離到妥布霉素生物合成基因簇［5］，有望給妥布霉素的生產(chǎn)帶來質(zhì)的飛躍，但闡明各個基因的功能并將其運用于工業(yè)化生產(chǎn)仍需一段過程。本文從菌種選育和工藝優(yōu)化兩方面進行研究，穩(wěn)定并提高了妥布霉素工業(yè)化生產(chǎn)，取得了實效。

1材料與方法

實驗材料

菌種黑暗鏈霉菌(Streptomycestenebrarius)Ts228；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)［CMCC(B)63501］，本實驗室保藏菌。

培養(yǎng)基(%)①斜面：葡萄糖，蛋白胨，氯化鉀，F(xiàn)eSO4·7H2O，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，瓊脂，pH自然；②種子：葡萄糖，玉米淀粉，黃豆餅粉，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，氯化鉀，CaCl2，pH自然；③發(fā)酵：葡萄糖，玉米粉，黃豆餅粉，硫酸銨，硫酸鎂，碳酸鈣，硫酸鋅，玉米淀粉，豆油，～。

儀器生化培養(yǎng)箱(LRH250A)；220r/min搖瓶機(自制)；15L種子罐和50L發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司)；臺式離心機(TGL16G)。

妥布霉素標準品和生測培養(yǎng)基：中國生物制品檢定所。

分析方法

發(fā)酵效價采用生物檢定法［6］；組分檢測用薄板層析［6］和HPLC法［7］。菌絲濃度測定，取發(fā)酵液10ml，3000r/min離心10min，去上清液后的固體物作為相對菌絲濃度。其它項目(總糖、還原糖、氨基氮等)均采用工業(yè)化常規(guī)分析法［8］。

2結(jié)果與討論

自然分離

出發(fā)菌株黑暗鏈霉菌Ts228主產(chǎn)尼拉霉素2，4和5′三個組分，菌落較大，孢子乳白，生測效價為3260u/ml。該菌株的單孢子懸液經(jīng)自然分離獲得白色和淡黃色兩類菌落，瓊脂塊法檢測菌落的抑菌效果。結(jié)果顯示白色菌落抑菌活性高于淡黃色菌落，具備較好的生產(chǎn)潛力；淡黃色菌落在多次測定中抑菌活性均較低，參照文獻［9］認為該菌落形態(tài)為退化株，不宜做出發(fā)菌。對白色菌落進行多次分離純化，獲得一比出發(fā)菌株提高%，編號為Tn17的高產(chǎn)菌株。

紫外誘變處理

取Tn17菌株，制作單孢子懸液，分別在30W紫外燈下照射10、30、50、70和90s，然后分離單菌落，進行瓊脂塊初篩，搖瓶發(fā)酵復篩，結(jié)果見表1。

由表1可見，經(jīng)紫外照射效價均有所提高。隨著照射劑量的增加，死亡率漸次升高，正變率降低，負變率升高。其中50s為最宜劑量，致死率為%，正變率為%，負變率為%，最高增幅為%，此高產(chǎn)菌株編號為Tv204。表1Tn17紫外線照射時間與突變率的關系

耐自身代謝產(chǎn)物的分離篩選

依據(jù)高效價具有高抗性，高抗性不等于高效價的原則，利用抗自身代謝產(chǎn)物對抗生素產(chǎn)生菌進行選育是提高抗生素產(chǎn)量的有效手段。在培養(yǎng)基上加入不同劑量的妥布霉素，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增大，菌株因進行適應調(diào)整，生長速度減慢，死亡率增大。Tv204菌株在1000～4000u/ml的平板上均可生長，最宜劑量為3000u/ml，此時生長周期為5d，菌落形態(tài)無明顯變異。經(jīng)耐受處理獲得效價提高%的高產(chǎn)菌株，編號為Tt49。

菌株Tt49生長特性考察

(1)斜面優(yōu)質(zhì)孢子培養(yǎng)時間的確定優(yōu)質(zhì)孢子的界定，用肉眼觀察或顯微鏡觀察都難以作出判斷。界定優(yōu)質(zhì)孢子還是以斜面培養(yǎng)時間結(jié)合搖瓶發(fā)酵效價的方法，考察它們的相關性。為此設計了在其它條件相同的情況下，取不同培養(yǎng)時間的斜面進行搖瓶發(fā)酵，以發(fā)酵效價最高所對應的斜面培養(yǎng)時間作為界定斜面優(yōu)質(zhì)孢子培養(yǎng)時間的準則。經(jīng)反復考察，斜面培養(yǎng)96h最好，結(jié)果見表2。

(2)傳代對生產(chǎn)力穩(wěn)定性的影響菌株傳代是否穩(wěn)定是決定能否進入工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵，為了考察所篩選菌株的傳代穩(wěn)定性，對Tt49菌株連續(xù)傳代，第1代斜面Fl，第2代斜面F2，第3代斜面F3，第10代斜面F10，分別進行搖瓶發(fā)酵。經(jīng)測定，Tt49菌株各子代發(fā)酵效價均落在4800～5300u/ml，波動較小，可以認為是穩(wěn)定的。

(3)冷藏對穩(wěn)定性的影響為了考察冷藏對斜面孢子穩(wěn)定性的影響，將置于4℃冰箱保存不同時間的表2斜面孢子培養(yǎng)時間對效價的影響由表3可見，斜面在冰箱保存7d內(nèi)，對發(fā)酵效價影響不大；保存時間12d以上，不僅對種子的菌絲形態(tài)(鏡檢)，而且對發(fā)酵效價均有明顯的影響。因此建議采取低溫干燥予以保存，生產(chǎn)斜面以新鮮為宜。

種子特性考察

(1)種齡的確定種齡控制不當，影響菌種生產(chǎn)能力的發(fā)揮。移種過早，潛伏期較長，甚至長不起來，即使生長了也容易衰老；移種太晚，種子走向衰老，不利于發(fā)酵和合成抗生素。為此，考察了種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵效價的影響，借此來確定合理的菌齡，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，移種時間控制在16～20h，對效價無太大影響，總效價均在4800u/ml以上。18h(，菌濃10%)移種，發(fā)酵效價最高，此時種子液顏色轉(zhuǎn)黃，出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，鏡檢菌絲粗壯，分支多，染色深。當接種時間延長到24h時，種子菌絲開始變細、變長，空胞逐漸增多，發(fā)酵效價反而有所降低。由表4數(shù)據(jù)還可以看出，種子的菌絲濃度高不等于種子質(zhì)量好，22h的種子濃度達12%，但最終發(fā)酵效價不高，因此，表3冷藏時間對生產(chǎn)力的影響把握好合適的菌齡是把握好發(fā)酵的關鍵之一。

(2)接種量的確定接種量的多少，決定了產(chǎn)生菌在發(fā)酵開始的生長繁殖速度和潛伏期的長短，同時也影響其最終產(chǎn)抗生素的水平，因此，確定菌齡之后，對接種量進行考察。將培養(yǎng)18h的種子按不同接種量(1%，3%，5%，8%，10%，15%)接入發(fā)酵瓶(40ml/250ml)，37℃，250r/min搖床培養(yǎng)110h，考察接種量對發(fā)酵效價的影響，結(jié)果顯示接種量10%時發(fā)酵效價最高。

(3)溶氧對發(fā)酵效價的影響溶解氧對妥布霉素發(fā)酵至關重要［10，11］。菌體在自身生長、繁殖及合成次級代謝產(chǎn)物的過程中都需要一定量的氧氣。溶氧過低，影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成，特別是影響糖的代謝；但過大的溶氧量導致菌絲瘋長，對生產(chǎn)不利。妥布霉素發(fā)酵中黑暗鏈霉菌的生長是為了達到一定的菌密度，以便在分泌期有

紫外誘變結(jié)合耐受處理是篩選氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株的有效手段。本研究通過此獲得比出發(fā)菌株增產(chǎn)180%的高產(chǎn)菌株Tt49，發(fā)酵水平達5865u/ml。高產(chǎn)菌株Tt49斜面生長周期4d，傳代穩(wěn)定，可冷藏7d，種齡18h，接種量10%。溶解氧對于黑暗鏈霉菌的深層發(fā)酵至關重要，發(fā)酵罐上可通過改變攪拌轉(zhuǎn)速和改變通氣量來改變?nèi)苎鯘舛取?/p>

根據(jù)溶氧曲線，優(yōu)化發(fā)酵工藝，獲得一套較適合氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株Tt49的代謝曲線特性圖。按照該曲線特性圖進行調(diào)控，可使抗生素生產(chǎn)水平接近于搖瓶的生產(chǎn)水平，充分發(fā)揮了菌株的抗生素生物合成潛力，達到了較為理想的效果。

【參考文獻】

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