應(yīng)激對(duì)雄性小鼠垂體

應(yīng)激對(duì)雄性小鼠垂體【摘要】目的：觀察應(yīng)激對(duì)雄性小鼠垂體-性腺功能的影響，建立應(yīng)激性性機(jī)能下降動(dòng)物模型。方法：利用電刺激方法使成熟雄性小鼠處于重復(fù)應(yīng)激狀態(tài)，然后觀察雄鼠捕捉雌性小鼠的性行為活動(dòng)，并用放射免疫方法測(cè)定血清中睪酮和促黃體生成素的水平。結(jié)果：重復(fù)電刺激應(yīng)激后，雄性小鼠捕捉雌性小鼠的行為明顯減少，表現(xiàn)為跨騎潛伏期延長(zhǎng)，舔舐與跨騎次數(shù)減少。而且血清睪酮與促黃體生成素水平均下降。結(jié)論：重復(fù)電刺激應(yīng)激可作為應(yīng)激性性功能下降動(dòng)物模型應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】垂體-性腺軸；應(yīng)激；電刺激；性功能；睪酮；促黃體生成素

[Abstract]Objective：Toobservetheeffectofstressonfunctionofhypophysial-gonadalaxisinmaturemalemice，andestablishthemodelofdeclinedsexualfunctioninducedbystress.Methods:Maturemalemousewasdealtedwitheletricalstimulationtomakeitinstress，thenthesexualbehaviourofmalemicecapturingfemalemicewasobservedandthetestosteroneandluteinizinghormoneinmouseserumweredeterminedbyradioimmunoassaykit.Results:Afterrepeatedelectricalstimulationofstress，malemouseactionofcapturingfemalemousesignificantlyreduced.Itmanifestedthatlatentperiodofmountingbehaviorextendedandfrequencyoflickingandmountingdecreased，andallthedifferenceshadstatisticsignificant.Thetestosteroneandluteinizinghormonelevelsinmouseserumdeclined.Conclusion:Repeatedelectricalstimulationofstresscanbeusedtoestablishthemodelofdeclinedsexualfunctioninducedbystress.

[Keywords]Hypophysial-gonadalaxis；Stress；Electricalstimulation；Sexualfunction；Testosterone；Luteinizinghormone

應(yīng)激是指內(nèi)外環(huán)境劇變刺激時(shí)，機(jī)體出現(xiàn)的包括精神、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等的綜合應(yīng)答狀態(tài)。任何來(lái)自環(huán)境、社會(huì)、工作、生活的軀體、精神、心理刺激均能使機(jī)體處于軀體或心理的應(yīng)激之中。應(yīng)激對(duì)于生物體而言，可以是一種積極的挑戰(zhàn)，也可以是一次創(chuàng)傷性的經(jīng)歷。只有應(yīng)激過(guò)于強(qiáng)烈、持久或個(gè)體耐受性差時(shí)，應(yīng)激才作為一種有害的因素，導(dǎo)致病變。生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)應(yīng)激刺激尤為敏感，應(yīng)激已成為生殖內(nèi)分泌疾病常見而重要的原因。建立應(yīng)激性性功能下降動(dòng)物模型可以供改善性功能、調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、抗應(yīng)激以及延緩衰老類藥物的研究。有研究報(bào)道應(yīng)激可導(dǎo)致雄性小鼠的性功能障礙[1-2]。應(yīng)激動(dòng)物的行為學(xué)和內(nèi)分泌改變，是觀察動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的指征。本實(shí)驗(yàn)用反復(fù)電刺激的方法對(duì)成熟雄性小鼠進(jìn)行應(yīng)激，觀察應(yīng)激對(duì)小鼠性功能的影響。并同時(shí)測(cè)定血清中睪酮和促黃體生成素水平的變化。

1材料與方法

動(dòng)物成年雄性小鼠40只，體重22~26g。雌性小鼠若干只，體重16~20g，均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供2007-0021）。

藥品、試劑及儀器己烯雌酚注射液；睪酮放射免疫分析藥盒，促黃體生成激素免疫放射分析藥盒；電刺激器，全自動(dòng)放射免疫γ計(jì)數(shù)儀。

實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物分組及處理方法取40只性成熟雄性小鼠，動(dòng)情期雌鼠若干以及非動(dòng)情期雌鼠若干。成熟雄性鼠按1∶1比例與動(dòng)情期雌鼠合籠2天，使之獲得性經(jīng)驗(yàn)，然后隔日進(jìn)行對(duì)雄鼠的篩選，將雄鼠1只放入籠中10min適應(yīng)環(huán)境，然后每籠放入非動(dòng)情期雌鼠1只，根據(jù)是否有屢次捕捉雌性小鼠的現(xiàn)象，把具有捕捉能力的小鼠挑選出來(lái)。然后將其按體重均衡隨機(jī)分成兩組，即對(duì)照組和應(yīng)激組，應(yīng)激組應(yīng)用反復(fù)電刺激，使之處于應(yīng)激狀態(tài)，連續(xù)7天。應(yīng)激方法根據(jù)文獻(xiàn)并稍有變動(dòng)，將小鼠放入刺激盒中，接受電刺激應(yīng)激，電壓36V，每秒電擊1次，連續(xù)電擊10次，隔50s再電擊10次，如此進(jìn)行10次循環(huán)，電擊安排在每天下午2點(diǎn)，每天電擊1次，連續(xù)7天。

捕捉潛伏期與捕捉次數(shù)測(cè)定于末次給藥60min后，將1只雄性小鼠放入籠中10min適應(yīng)環(huán)境，然后每籠加入1只非動(dòng)情期雌性小鼠，并記錄如下捕捉行為：舔舐、跨騎。舔舐行為即是雄性小鼠對(duì)雌性小鼠有追尾并舔舐雌鼠生殖器官的現(xiàn)象，跨騎行為即為雄鼠兩前肢爬上雌鼠背部，并作性交狀。用秒表人工目測(cè)計(jì)數(shù)，記錄自雌鼠投入至雄性鼠發(fā)生第1次捕捉雌鼠的時(shí)間，15分鐘內(nèi)雄鼠捕捉雌鼠的次數(shù)。

血清中睪酮與促黃體生成素的水平的測(cè)定捕捉實(shí)驗(yàn)完成后，摘眼球取血1ml，待血凝固后，2500rpm，15min離心，獲得血清，按放免試劑盒說(shuō)明書提供的方法測(cè)定各組小鼠的血清中睪酮與促黃體生成素的水平，并作復(fù)管測(cè)試，取平均值進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用x±s表示，用統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

應(yīng)激對(duì)雄性小鼠捕捉能力的影響見表1。重復(fù)電刺激應(yīng)激7天后，雄性小鼠捕捉雌性小鼠的行為明顯減少，表現(xiàn)為跨騎潛伏期延長(zhǎng)，舔舐與跨騎次數(shù)減少。

應(yīng)激雄性小鼠血清睪酮和促黃體生成素的影響見表2。

3討論

強(qiáng)烈身心應(yīng)激尤其是長(zhǎng)期慢性應(yīng)激嚴(yán)重影響著人類身心健康，并加速機(jī)體衰老過(guò)程。臨床上與應(yīng)激相關(guān)的疾病屢見不鮮，并突出表現(xiàn)在生殖內(nèi)分泌疾病。身心應(yīng)激成為月經(jīng)失調(diào)(月經(jīng)先期或遲后)、無(wú)排卵月經(jīng)、高雄激素血癥(多毛、多囊卵巢)、閉經(jīng)、不孕、性功能障礙等常見而重要的致病因素[5-6]。

已有研究表明，嚴(yán)重的軀體和心理應(yīng)激均能抑制或損傷下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明急性和慢性制動(dòng)應(yīng)激可使大鼠血漿T、LH和促黃體生成素釋放激素水平顯著降低[7-8]。小鼠接受慢性懸吊應(yīng)激也可見血漿T水平明顯降低，同時(shí)出現(xiàn)性行為低下或缺損。

現(xiàn)在越來(lái)越多證據(jù)表明，HPG軸應(yīng)激性損害與下丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激性亢進(jìn)密切相關(guān)。應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，下丘腦促腎上腺皮質(zhì)釋放激素及腎上腺糖皮質(zhì)激素(GCS)大量釋放，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，CRF和GCS在下丘腦、垂體、性腺多水平均可抑制HPG軸功能。表現(xiàn)為抑制垂體促性腺功能，使促性腺激素分泌減少，而且可直接作用于性腺功能，減少性激素分泌。

在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠接受反復(fù)電刺激應(yīng)激可使血漿T，LH的水平顯著降低，同時(shí)出現(xiàn)性行為低下或缺損。這說(shuō)明電刺激應(yīng)激后，由于機(jī)體的腎上腺軸亢進(jìn)，CRF和GCS的升高，導(dǎo)致了促黃體生成素以及睪酮水平下降，從而致使性行為低下。故我們用此方法建立的模型可以作為應(yīng)激性性功能下降動(dòng)物模型應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)方法在參照前人研究基礎(chǔ)上加以改進(jìn)：在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選，挑選出捕捉能力強(qiáng)的雄性小鼠，即有多次舔舐追尾及騎跨行為。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于沒(méi)有進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中也有許多小鼠性行為很低下，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法解釋。而經(jīng)過(guò)預(yù)篩后，動(dòng)物的同質(zhì)性得到了保證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較理想、可靠；非動(dòng)情期雌鼠一般不接受雄性鼠交配要求，致使雄鼠對(duì)雌鼠產(chǎn)生屢捕現(xiàn)象，屢次捕捉的頻率反映雄鼠的性機(jī)能狀態(tài)。所以在進(jìn)行捕捉實(shí)驗(yàn)時(shí)，筆者認(rèn)為使用非動(dòng)情期雌鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)較為妥當(dāng)。而要使雄性小鼠獲得性交經(jīng)驗(yàn)則要使用動(dòng)情期雌鼠；捕捉實(shí)驗(yàn)要求比較高，小鼠要精心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境要好，勤換墊料，充足飲食，避免應(yīng)激以外的因素導(dǎo)致小鼠性功能受到影響。進(jìn)行觀察捕捉現(xiàn)象時(shí)，嚴(yán)格控制環(huán)境，在弱光，安靜環(huán)境下進(jìn)行效果最佳，一般實(shí)驗(yàn)安排在晚上7點(diǎn)至10點(diǎn)較好。另外我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激7天后，并沒(méi)有立即處死小鼠，于3天之后我們?yōu)榍笞C電刺激應(yīng)激的持續(xù)性，再次對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)電刺激對(duì)小鼠性行為功能的影響仍未恢復(fù)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)激對(duì)于生物體的機(jī)能的危害在短時(shí)間內(nèi)不易恢復(fù)。

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