CIK細胞對乳腺癌細胞株抗增殖及誘導凋亡的作用

CIK細胞對乳腺癌細胞株抗增殖及誘導凋亡的作用

【摘要】目的研究多種細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)對ZK751乳腺癌細胞株的抗增殖和誘導凋亡作用，并探討其作用機制。方法應用MTT法檢測CIK細胞對ZK751乳腺癌細胞株的抗增殖作用的影響及細胞毒活性；通過倒置顯微鏡、HE染色、透射電鏡觀察凋亡細胞的形態(tài)學改變。結果MTT比色法表明隨著CIK細胞與乳腺癌細胞效靶比增加及作用時間延長，抑制率明顯增強。CIK細胞作用于乳腺癌細胞24h后，形態(tài)學觀察乳腺癌細胞發(fā)生凋亡或壞死。結論CIK細胞是一種新型高效具有較強殺傷體外乳腺癌細胞的免疫活性細胞。

【關鍵詞】CIK細胞ZK751乳腺癌細胞抗腫瘤細胞凋亡

0引言

從80年代Rosenberg等觀察到在患非免疫系統(tǒng)腫瘤的動物中給予重組白細胞介素2，動物的淋巴細胞可以調(diào)節(jié)腫瘤的消退和轉(zhuǎn)移以來，細胞免疫治療就迅速擴展開來，人們先后研究了淋巴因子激活的殺傷細胞，腫瘤浸潤淋巴(TIL)細胞，CD3單抗激活的殺傷(CD3AK)細胞，但是由于細胞來源困難、細胞擴增倍數(shù)低或者細胞毒力不高等原因，上述細胞的臨床應用受到極大限制。為此，美國斯坦福大學醫(yī)學院骨髓移植研究中心1991年首先報道了具有高增殖能力和高細胞毒性的多種細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)細胞[1]。目前，國內(nèi)尚未見應用CIK細胞體外誘導腫瘤細胞凋亡的形態(tài)學觀察和機制探討。本課題通過光鏡、電鏡觀察了CIK細胞對ZK751乳腺癌細胞株作用的形態(tài)學變化。

1材料與方法

材料

藥品及試劑基因重組人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴細胞分離液、基因重組人IFNγ、RPMIMedium1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT。

腫瘤細胞ZK751乳腺癌細胞株由西安醫(yī)科大學腫瘤研究所提供，由本科室體外傳代培養(yǎng)。

方法

效應細胞制備取健康者的成分白細胞用淋巴細胞分離液經(jīng)Ficoll密度梯度離心法提取單個核細胞，此細胞被重懸并保存于IMDM培養(yǎng)液中。調(diào)至１×10６個/ml，第0d加入IFNγ2000u/ml，PHA100μg/ml放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，第1d加CD3McAb5μg/ml,重組人IL21000u/ml,繼續(xù)培養(yǎng)。每3d半量換液，同時補加IL21000u/ml，PHA100μg/ml調(diào)細胞濃度至１×10６個/ml，第14d收獲細胞。

MTT法測量細胞存活率取對數(shù)生長期乳腺癌細胞％臺盼藍染色及計數(shù)，調(diào)整濃度至1×105個/ml細胞懸液為靶細胞，取培養(yǎng)14d的CIK細胞調(diào)整濃度為１×10６個/ml為效應細胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另設單獨效應細胞組及單獨靶細胞組為陰性對照組、每組重復8孔，置于37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h后取出，每孔加MTT20μl(5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h后小心棄去上清液，加入二甲基亞砜160μl,輕輕振蕩10min后用酶聯(lián)免疫檢測儀λ＝490nm測吸光度值，殺傷率計算公式為：抑制率＝[１－(實驗孔A值－效應孔A值)/靶細胞孔A值]×100%

倒置顯微鏡觀察將CIK細胞和靶細胞以效靶比30∶1接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時在倒置顯微鏡下觀察。設對照組為單純培養(yǎng)的乳腺癌細胞。

HE染色觀察將CIK細胞和靶細胞以效靶比30∶1接種于已放置支持物小蓋片的12孔培養(yǎng)板內(nèi)。對照組：加等量生理鹽水。連續(xù)培養(yǎng)24h后取出小蓋片。將小蓋片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，蘇木素2min，水洗3min，％鹽酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊紅30s，脫水、透明及封固。

透射電鏡觀察將CIK細胞和靶細胞以效靶比30∶1混合的4、12及24h細胞離心，棄去上清液，剩下的細胞團用%戊二醛固定、梯度丙酮脫水;Epon812混合樹脂包埋;超薄切片機切片;醋酸鈉和檸檬酸鉛染色;透射電鏡觀察、照相。

統(tǒng)計學處理

應用軟件：進行統(tǒng)計學處理，MTT法檢測的抑制率之間的比較采用t檢驗。

2結果

MTT法檢測CIK細胞對ZK751乳腺癌細胞的抗增殖及細胞毒結果

隨著效靶比增加及作用時間延長，其細胞毒性明顯增強。相同作用時間不同效靶比之間有顯著性差異，同一效靶比不同作用時間之間也有顯著性差異。當效靶比為30∶1時，其抑制率為%±%，接近半數(shù)抑制濃度，有效作用時間為24h，見表1。

表1用MTT法測定CIK細胞對ZK751乳腺癌細胞株的抑制率

Note:ComparedwiththeformeratthesametimeΔ;Comparedwiththeformeratthesametime*;ComparedwiththeformeratthesameE/T▲(n=6)

形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下觀察到CIK逐漸聚集到乳腺癌細胞周圍，呈典型的玫瑰花環(huán)狀改變，乳腺癌細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物，乳腺癌細胞逐漸模糊、消失。效靶細胞共育24h時乳腺癌細胞數(shù)明顯減少，48h乳腺癌細胞明顯漂浮，并且在培養(yǎng)液中出現(xiàn)碎片。對照組乳腺癌細胞仍貼壁生長，狀況良好。單獨CIK細胞未見趨動現(xiàn)象，均勻鋪滿視野，見圖1、2。

在透射電鏡下，體外培養(yǎng)的CIK細胞與ZK751乳腺癌細胞亦易于鑒別：前者細胞與外周血淋巴細胞相似。而乳腺癌細胞則核大而形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)很少，核仁大而致密，癌細胞表面有許多大小、形狀不一的突起，胞漿內(nèi)含有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。在效靶細胞共育4h后，效靶細胞直接接觸或呈犬牙狀交錯，可見到靶細胞核內(nèi)已開始濃縮的異染色質(zhì)，核仁分解為許多嗜鋨酸的細小顆粒，分布于核中央，核膜已經(jīng)模糊不清，胞漿內(nèi)線粒體外膜開始破壞，但細胞膜完整的細胞凋亡現(xiàn)象，見圖3。效靶細胞共育12h后，變性死亡的癌細胞逐漸增多，癌細胞死亡的方式以凋亡為主，可見大小不等的凋亡細胞和凋亡小體及散在的有質(zhì)膜包繞的細胞碎片。有的癌細胞遭到嚴重破壞，核高度濃縮，胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多空泡。效靶細胞共育24h后，絕大多數(shù)靶細胞死亡，可見細胞核碎裂，細胞膜不完整，細胞漿內(nèi)細胞器溶解形成碎片，見圖4。

圖1CIK細胞聚集到腫瘤細胞周圍呈典型的玫瑰花環(huán)狀(HE×400倍）

圖2腫瘤細胞胞漿出現(xiàn)顆粒狀物，細胞膜模糊、消失

圖3效靶細胞共育4h后，效靶細胞直接接觸或呈犬牙狀交錯，可見細胞膜完整的細胞凋亡現(xiàn)象

圖4效靶細胞共育24h后，絕大多數(shù)靶細胞死亡，可見細胞核碎裂，細胞膜不完整的凋亡小體

3討論

CIK細胞是將人外周血單個核細胞在體外多種細胞因子共同培養(yǎng)一段作用時間后獲得的一群異質(zhì)細胞，是一類非主要組織相容性復合物和非T細胞受體限制性的免疫活性細胞，以CD3＋CD56＋T細胞為主。

利用細胞培養(yǎng)的篩選體系可以在體外對人體癌細胞進行抗癌效力檢測，從而加快篩選速度。本實驗通過MTT法觀察CIK細胞以不同濃度，不同效靶比作用于ZK751乳腺癌細胞不同作用時間后所測的抑制率。結果表明:隨著效靶比增加及作用時間延長，其細胞毒性明顯增強。相同作用時間不同效靶比之間有顯著性差異，同一效靶比不同作用時間之間也有顯著性差異。說明CIK細胞對ZK751乳腺癌細胞株均有抗增殖作用。倒置顯微鏡、光鏡和透射電鏡從細胞和亞細胞水平均觀察到CIK細胞具有較強的攻擊、殺傷ZK751乳腺癌細胞的功能。CIK細胞包圍靶細胞使靶細胞發(fā)生兩種變化。一種為細胞凋亡，表現(xiàn)為靶細胞體積縮小，胞漿減少，核固縮。另一種表現(xiàn)為靶細胞腫脹，胞膜破裂內(nèi)容物流出而壞死。目前關于CIK細胞對靶細胞的殺傷原理尚不清楚。實驗證明CIK細胞活化后產(chǎn)生大量炎性細胞因子如IFNr、TNFa、IL2等。不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應性間接殺傷腫瘤細胞。Mehta等認為CIK細胞對靶細胞殺傷有兩條途徑：第一，CIK細胞被淋巴細胞功能相關抗原－１有關識別結構激活導致胞漿毒性顆粒依賴性的溶細胞作用，這條途徑與胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度無關；第二，CIK細胞表面的CD3樣受體被結合而激活CIK細胞產(chǎn)生胞漿毒性顆粒介導的溶細胞作用，這條途徑與胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度有關；而且這兩種途徑最后都通過刺激CIK細胞釋放顆粒酶、穿孔素而裂解靶細胞，提示細胞裂解可能是殺傷靶細胞的主要機制。

在與靶細胞結合的部分CIK細胞內(nèi)有一種特殊的微管泡狀結構，表面光滑，這種特殊結構可能與CIK細胞的殺傷功能有關。還有的CIK細胞內(nèi)溶酶體含量增多，這與CIK細胞殺傷活性有關，具有溶解活性的殺傷細胞是富含溶酶體的細胞。

本實驗結果顯示出CIK細胞抗腫瘤作用的巨大潛力，為CIK細胞應用于臨床治療提供了實驗依據(jù)。

【參考文獻】

［1］黃文榮.細胞因子誘導的殺傷細胞的研究現(xiàn)狀[J].腫瘤防治研究,2000，27：157159.

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