番鴨呼腸孤病毒病防控技術規(guī)程

番鴨呼腸孤病毒病防控技術規(guī)程1范圍本標準規(guī)定了番鴨呼腸孤病毒病的診斷、預防和控制措施。本標準適用于番鴨呼腸孤病毒病的預防和控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB13078飼料衛(wèi)生標準GB/T36195畜禽糞便無害化處理技術規(guī)范NY/T1167畜禽場環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制規(guī)范NY5027無公害產(chǎn)品畜禽飲用水水質(zhì)NT/T5030無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準則《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》農(nóng)醫(yī)發(fā)（2017）25號3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。番鴨呼腸孤病毒?。∕uscovyduckreovirusdisease，MDRVD）是由番鴨呼腸孤病毒（MDRV）引起的以番鴨軟腳、肝脾灰白色壞死點為特征的急性、接觸性傳染病，又稱“番鴨肝白點病”或“花肝病”，該病屬于免疫抑制性疫病。4診斷4.1流行病學本病在自然條件下只感染雛番鴨，發(fā)病日齡在4～50日齡之間，其中以7～35日齡的感染最為常見，日齡越小發(fā)病的危害程度越嚴重，病程長短不一，通常為14～21天。本病一年四季均可發(fā)生，但在冬春季節(jié)較少見，天氣炎熱、潮濕，鴨群應激時發(fā)病率升高，病原可通過消化道和呼吸道感染進行水平傳播，也可通過種鴨進行垂直傳播。4.2臨床癥狀發(fā)病番鴨精神不振，羽毛蓬亂無XX，食欲減少或廢絕，畏冷扎堆，不愿走動，腹瀉，排綠色或黃白色稀糞，有大量稀糞粘附在肛門周圍，泄殖腔擴張、外翻，大部分番鴨表現(xiàn)為軟腳，病鴨死亡快，經(jīng)過3-5天，發(fā)病率和死亡率逐漸增加，病程稍長的患病番鴨會出現(xiàn)趾關節(jié)或跗關節(jié)腫大、跛行，耐過病番鴨生長發(fā)育遲緩，成為僵鴨。4.3病理變化對病死番鴨的病變主要集中在肝臟和脾臟，肝臟腫大、質(zhì)脆，表面有出血點或出血斑，表面和實質(zhì)密布大量肉眼可見的壞死點，呈灰白色或灰黃色，甚至連成花斑樣病灶。脾臟腫大呈暗紅或黑紫色，質(zhì)地變硬，表面和切面實質(zhì)有大小不等白色或黃白色壞死點或壞死灶；腎臟腫大、出血；隨著病程的XX部分病例可見嚴重的心包積液、心包炎和肝周炎。4.4實驗室檢測4.4.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）檢測RT-PCR檢測方法見附錄A。陽性對照出現(xiàn)300bp的擴增條帶，陰性對照無條帶時檢測結(jié)果成立，當被檢樣品擴增出與陽性對照大小一致的特異性條帶時為陽性，否則為陰性。4.4.2間接免疫熒光（IFA）檢測IFA檢測方法見附錄B。在200倍或400倍熒光顯微鏡下觀察，空白樣品無熒光時檢測結(jié)果成立，當被檢組織樣品出現(xiàn)明顯的亮綠色熒光時為陽性，否則為陰性。4.5結(jié)果判定4.5.1符合4.1、4.2和4.3的，判定為疑似感染。4.5.2符合4.1、4.2和4.3，且符合4.4.1或4.4.2時，判定被檢番鴨樣品存在MDRV感染。5疫情處理當疫情發(fā)生時，應按照《中華人民共和國動物防疫法》的規(guī)定進行處理。6預防與控制6.1預防6.1.1引種管理異地引入種番鴨和種蛋時，應取得原產(chǎn)地動物防疫監(jiān)督機構的檢疫合格證明。到達引入地后，種番鴨和種蛋孵化的雛番鴨必須隔離飼養(yǎng)15天以上，并有引入地動物防疫監(jiān)督機構進行檢測，確認健康無疫后，方可進行混群飼養(yǎng)。6.1.2孵化管理由于MDRV可以垂直傳播，因此發(fā)生過該病的番鴨群不能留作種用。6.1.2.2帶毒的種蛋和孵化出的雛鴨可能成為孵化場的重要感染源，加強孵化管理尤為重要。收集好的種蛋在入孵前，采用福爾馬林熏蒸消毒，或使用其他高效低毒消毒藥劑進行消毒，消毒藥劑按照使用說明書正確使用。6.1.2.3孵化室底面和墻壁可用2%燒堿水噴灑消毒，孵化室和孵化箱的空間采用爾馬林熏蒸消毒。出雛箱采用一次性紙箱或經(jīng)過嚴格消毒的塑料箱，批次出雛結(jié)束后，對使用過的出雛箱或其他器具先采用2%的燒堿水或2%的漂白粉浸泡2～3小時后取出，清水沖洗，晾干備用。6.1.2.4出雛結(jié)束后，及時清除出雛間和疫苗接種間的灰塵和絨毛，采用2%的燒堿水進行噴灑消毒。6.1.3飼養(yǎng)管理6.1.3.1飼料應符合GB13078的要求，飲水水質(zhì)應符合NY5027的要求。6.1.3.1加強雛鴨的養(yǎng)殖管理，做好育雛舍的保溫工作，盡可能減少和降低噪音、驚嚇和疫苗接種等因素造成的鴨群應激，番鴨舍的環(huán)境應符合NY/T1167的要求。6.1.3.3番鴨場應采取分批次生產(chǎn)，不同日齡的番鴨群不能混樣。控制人員、車輛和物資出入，嚴格執(zhí)行場區(qū)清潔的消毒程序，番鴨場衛(wèi)生管理標準應符合NY/T1167的要求。按照GB/T36195的規(guī)定進行對番鴨的糞便和墊料等污染物進行及時處理。6.1.4免疫接種雛番鴨在1日齡使用番鴨呼腸孤病毒病活疫苗（CA株）進行免疫，每羽番鴨腿部肌肉注射1羽份，番鴨出殼后免疫1次即可；或使用經(jīng)國務院獸醫(yī)主管部門批準上市的其他番鴨呼腸孤病毒病疫苗，并按使用說明書要求進行免疫。6.2控制6.2.1疫情上報發(fā)生該病時應當向當?shù)孬F醫(yī)主管部門或動物疫病預防控制機構進行報告，并在相關部門的指導下處理疫情。6.2.2消毒管理及時隔離發(fā)病番鴨群，對鴨舍、環(huán)境和用具等進行嚴格消毒，參照NY/T1167中的規(guī)定執(zhí)行。6.2.3治療措施該病目前無特效治療藥物，對發(fā)生該病的番鴨群，采用番鴨呼腸孤病毒精制卵黃抗體注射液進行緊急治療和預防，用法和用量按照使用說明書執(zhí)行。在飼料或飲水中添加黃芪多糖等抗病毒中藥制劑提高番鴨群的抗病毒能力；存在繼發(fā)細菌感染時應通過藥敏試驗選擇高敏抗生素進行治療，藥物的使用應符合NY/T5030的規(guī)定；同時在飲水中加入多種維生素和葡萄糖等進行輔助治療。6.2.4無害化處理對病死番鴨和廢棄物的處理應符合農(nóng)醫(yī)法[2017]25號的規(guī)定；對糞便及其他可能被污染的物品按照GB/T36195中的規(guī)定進行無害化處理。

附錄A（規(guī)范性附錄）番鴨呼腸孤病毒RT-PCR檢測A.1陽性對照的制備A.1.1引物P1:5’-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3’；P2:5’-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3’，擴增產(chǎn)物長度為300bp。A.1.2番鴨呼腸孤病毒RNA的提取和cDNA合成收集接種MDRV的SPF鴨胚尿囊液，按照市售RNA提取試劑盒操作說明書提取RNA，按照市售商品化cDNA合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。A.1.3PCR反應體系和反應程序PCR反應體系（25uL）：10×PCRbuffer（含MgCl2）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，引物P1、P2各1μL（25pmol/μL），合成cDNA2μL，ddH2O11μL。PCR反應程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min，4℃保存。A.1.4PCR產(chǎn)物電泳和回收用微量移液器向25μLPCR產(chǎn)物加入5PCR產(chǎn)物6×上樣緩沖液，充分混合后，加入1%X脂糖凝膠的樣品孔中，以DL2000DNAMarker為指示，在TAE電泳緩沖液中，電壓90V，時間40min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。根據(jù)DL2000DNAMarker確定MDRV擴增的特異性條帶，用手術刀切下該條帶的凝膠塊，按照市售商品化的凝膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的回收。A.1.4PCR產(chǎn)物克隆A.1.4.1采用商品化的T4克隆載體和DH5ɑ感受態(tài)細胞將PCR產(chǎn)物連接入載體并轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細胞中，具體操作參照T4克隆載體和DH5ɑ感受態(tài)細胞的使用說明書。A.1.4.2利將轉(zhuǎn)化后的DH5ɑ接種到含有X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基進行陽性克隆的篩選，攜帶有T4克隆載體的菌落為白色。A.1.4.2挑選白色菌落在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8小時，采用市售商品化的細菌質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取細菌質(zhì)粒DNA，采用A.1.3中的PCR反應體系（以質(zhì)粒DNA替代cDNA）和程序進行陽性克隆的鑒定。A.1.5質(zhì)粒的提取將鑒定為陽性的克隆菌株，接種到含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8小時，采用市售商品化的細菌質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取細菌質(zhì)粒DNA，所提取的質(zhì)粒作為番鴨呼腸孤病毒RT-PCR檢測的陽性對照。A.2番鴨臨床組織樣品的檢測A.2.1組織樣品RNA的提取和cDNA合成采集臨床發(fā)病番鴨的肝臟或脾臟組織，加入等量的生理鹽水進行研磨，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min，取上清作為檢測樣品，參照A.1.2中的步驟進行檢測樣品RNA的提取和cDNA的合成。A.2.2PCR反應體系和反應程序樣品檢測的PCR反應體系和反應程序參照A.1.3，并以制作的陽性質(zhì)粒為擴增模板設置陽性對照，以ddH2O為擴增模板設置陰性對照。A.2.2結(jié)果判定PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的X脂糖凝膠電泳，XX性對照出現(xiàn)300bp的條帶，陰性對照無條帶時，檢測結(jié)果成立。當被檢樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性條帶時，判定為MDRV核酸檢測陽性，否則判定為陰性。

附錄B（規(guī)范性附錄）番鴨呼腸孤病毒IFA檢測B.1切片制備采集發(fā)病番鴨肝、脾和腎等組織器官保存在-20℃，通過冷凍切片機進行組織樣品的冰凍切片，將冷凍的切片立即與室溫的載玻貼合片上，用預冷的丙酮固定切片10min，清水沖洗后立即進行檢測或在-20℃凍存?zhèn)溆谩.2IFA檢測步驟取上述制備好的切片加1:100稀釋的MDRV的單克隆抗體，并以生理鹽水代