淺論多糖生物膜在骨組織工程中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究

淺論多糖生物膜在骨組織工程中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的在骨組織工程的載體外包裹多糖生物膜(PSBM)，減少種子細(xì)胞在復(fù)合載體時(shí)的外溢逃出，驗(yàn)證其在組織工程中應(yīng)用的可行性。方法用全骨髓法獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增后，取第三代細(xì)胞種植于支架材料載體多孔納米磷灰石－硅灰石生物活性玻璃陶瓷/殼聚糖復(fù)合支架材料上，分2組，實(shí)驗(yàn)組載體外用多糖生物膜物理包裹，對照組不包裹多糖生物膜，觀察載體外培養(yǎng)皿上的細(xì)胞生長數(shù)量；MTT檢測細(xì)胞活力；電鏡觀察載體上細(xì)胞粘附生長情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)板上載體外漏細(xì)胞較少，對照外漏細(xì)胞較多：MTT檢測兩組細(xì)胞活力差別無顯著性；電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組載體上細(xì)胞粘附生長較對照組稍優(yōu)。結(jié)論多糖生物膜在骨組織工程中具有應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】多糖生物膜骨髓基質(zhì)干細(xì)胞支架材料組織工程

Abstract:ObjectiveTopackbonetissueengineeringcarrierwithpolysaccharidebiomembranetodecreaseseed-cellsleaking,andtoauthenticatethefeasibilityofapplyingpolysaccharidebiomembraneinbonetissueengineering.MethodsBonemarrowstromalcellswerederivedthroughwhole-bone-marrowmethod,and,afteramplificationinvitro,thecellsofthethirdgenerationwereimplantedinA-W-MGC/CS.Thenthecellsweredividedintotwogroups-anexperimentalgroupwithcarrierpackedwithPSBMandacontrolgroupwithcarrierun-packed.Thenumberofcellgrowinginculturedishoutofthecarrierwasobserved，thestateofcellvigorwasdetectedwithMTT,andthestateofcelladhesionwasobservedwithelectronmicroscope.ResultsThenumberofleakingcellintheexperimentalgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.TheresultofMTTdetectionshowedthatdifferenceofcellvigorbetweentwogroupswasun-significant(P＜).Thegrowingstateofcellintheexperimentalgroupwasbetterthanthatinthecontrolgroupunderelectronmicroscope.ConclusionsPolysaccharidebiomembranehasanappliedprospectinBonetissueengineering.

Keywords：polysaccharidebiomembrane;bonemarrowstromalstemcell;bracketmaterial;tissueengineering

骨組織工程的核心是在體外培養(yǎng)細(xì)胞，然后將細(xì)胞種植到具有一定結(jié)構(gòu)的三維支架上，再將這種細(xì)胞生物材料復(fù)合體植入骨缺損部位，通過生物過程使細(xì)胞長入多孔支架中，即經(jīng)過細(xì)胞間相互粘附、增殖、分化，分泌細(xì)胞外基質(zhì)最終形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，從而達(dá)到骨修復(fù)的目的。細(xì)胞和支架材料的相互作用又起到關(guān)鍵的作用，減少細(xì)胞復(fù)合材料又未貼附在支架材料這段時(shí)間的外漏，可以有效的減少種子細(xì)胞的損失，增加細(xì)胞與支架材料之間的作用時(shí)間，更利于細(xì)胞粘附。由中國海洋大學(xué)生命學(xué)院研制的多糖生物膜是一種安全無毒，具有很好生物相容性的細(xì)胞培養(yǎng)移植載體。多糖生物膜是由殼聚糖衍生物、透明質(zhì)酸及明膠按特定比例混合制成的膜型制劑。其分子量約為2000Da，透水率為10μL/。為了提高載體內(nèi)外液體中大分子物質(zhì)的流通，我們用顯微穿刺的方法在多糖生物膜上增加孔隙。耿燕、王曉莉［1，2］等將其應(yīng)用于眼科的研究。本實(shí)驗(yàn)研究將多糖生物膜應(yīng)用于骨組織工程的可行性。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物

2～3月齡清潔級日本大耳白兔1只，體重kg，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

實(shí)驗(yàn)材料

多孔納米磷灰石－硅灰石生物活性璃玻陶瓷/殼聚糖復(fù)合支架材料，多糖生物膜，高糖DMEM，胎牛血清(北京華美)，Hepes,％胰酶，MTT，二甲基亞砜，96孔一次性培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，JSM-5900LV掃描電鏡。

實(shí)驗(yàn)方法

BMSCs的分離培養(yǎng)

取～2月齡的日本大耳白兔，雌雄不限，速眠新II(mL/kg)肌注麻醉，無菌條件下于脛骨上端抽取約4mL骨髓，在超凈工作臺上將骨髓加入無菌培養(yǎng)瓶中，再加入4mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(以下稱生長培養(yǎng)基)充分吹打，按每瓶2mL加入到30cm2的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充2mL的生長培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后首次換液，以后每3天換液1次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待貼壁細(xì)胞接近80%融合后，結(jié)束原代培養(yǎng)。吸去生長培養(yǎng)基，用無血清DMEM洗1次，加入%胰蛋白酶mL/瓶消化3～5分鐘，并在倒置顯微鏡下觀察消化效果。當(dāng)有部分細(xì)胞脫壁、大部分細(xì)胞間隙變大時(shí)加入生長培養(yǎng)基mL/瓶終止消化。細(xì)胞沉淀用生長培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液并按1∶3比例分裝傳代，以后每3d換液1次。

BMSCs復(fù)合A-W-MGC/CS及包裹多糖生物膜

將制作好的A-W-MGC/CS，孔徑在100～500μm，孔隙率為80%～90%，經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后放置1個(gè)月，用前PBS沖洗3遍，用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡置于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中7天，去掉培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中自然晾干待用。將多糖生物膜修剪成5cm×3cm大小，浸泡于M的磷酸鹽緩沖液24小時(shí)，121℃高壓濕熱滅菌。手工將多糖生物膜從底面及側(cè)壁包裹晾干的A-W-MGC/CS復(fù)合支架材料可吸收線系好備用。取第三代BMSCs消化離心制成1×106的細(xì)胞懸液種植于實(shí)驗(yàn)組包裹有經(jīng)穿刺過的多糖生物膜的A-W-MGC/CS上，另一組細(xì)胞直接種植A-W-MGC/CS上，每組6塊，放入24孔培養(yǎng)板上，在37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中孵育。2h后翻面，4h后加入20％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每孔mL，培養(yǎng)7d，隔天更換培養(yǎng)液。

檢測項(xiàng)目

MTT值測定增值曲線的繪制

取第三代生長細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板上，分2組，實(shí)驗(yàn)組為浸泡有多糖生物膜的生長培養(yǎng)液，對照組為正常生長培養(yǎng)液。每板種植21個(gè)孔，每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞，200μL培養(yǎng)液，每48小時(shí)換液。每日取3孔細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長情況，加入20μLMTT，4h后盡量吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩10min，以490nm為測量波長，以空白孔為對照，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度值【D】，根據(jù)MTT值繪制細(xì)胞增殖曲線。

倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板上細(xì)胞外漏情況

24小時(shí)后取24孔培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察支架材料外，培養(yǎng)板底外漏的細(xì)胞貼壁生長情況并細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)=細(xì)胞種植總數(shù)-培養(yǎng)板底部外漏細(xì)胞數(shù)。種植率=細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)／細(xì)胞種植總數(shù)×100%。

電鏡觀察支架材料上細(xì)胞貼附生長情況

將聯(lián)合培養(yǎng)7d的細(xì)胞與支架復(fù)合體標(biāo)本分別取出后，PBS洗3次后，%戊二醛常溫下固定，60%～100%的乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換。臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，JSM-5900LV掃描電鏡分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)每日不同D均值為數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞增殖曲線(見圖3)。結(jié)果顯示：浸泡有多糖生物膜的實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明細(xì)胞在浸泡有多糖生物膜的生長培養(yǎng)基的生長增殖不受影響。

倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板上細(xì)胞外漏結(jié)果并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)

24小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察放有支架材料的24孔培養(yǎng)板的底面并細(xì)胞計(jì)數(shù)，如圖4，圖5所示，可見實(shí)驗(yàn)組外漏細(xì)胞較少，而對照則較多。

表124孔培養(yǎng)板的底面細(xì)胞計(jì)數(shù)

注：P＜,實(shí)驗(yàn)組和對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)為×105，種植率為88%；對照組細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)為×105，種植率為53%。

電鏡觀察支架材料上細(xì)胞貼附生長情況

如圖6，圖7所示，可見細(xì)胞在支架材料上貼附生長良好，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈不則球形，分布均勻，密度較大；對照組細(xì)胞分布不均勻，密度較少。

3討論

骨組織工程骨的體外構(gòu)建要求最大限度的保證使用的種子細(xì)胞參與成骨,減少種子細(xì)胞的流失。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞與載體復(fù)合時(shí)，細(xì)胞在載體內(nèi)的滯留與粘附是至關(guān)重要的兩個(gè)方面。細(xì)胞與支架材料表面的接觸、黏附及相互作用是組織工程學(xué)的第一步。細(xì)胞必須與材料黏附［3］,才能進(jìn)行遷移、分化和增殖。這種黏附作用在材料方面與材料的組成,親/疏水性,表面能拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其表面的生物特異性活性功能集團(tuán)等因素有關(guān)。為了提高細(xì)胞與支架材料間的黏附能力,對支架材料進(jìn)行必要的改性是非常必要的。近年來，對各種支架材料表面的親和力，粘附作用的研究較多，大多數(shù)解決的都是細(xì)胞在載體上粘附的問題［4-6］。而細(xì)胞在載體上的滯留時(shí)間，不僅影響到種子細(xì)胞的流失和數(shù)量，更間接影響細(xì)胞與支架材料的粘附，因此增加細(xì)胞在載體上的滯留時(shí)間，可以有效的解決這個(gè)問題。

細(xì)胞在細(xì)胞接種至載體表面時(shí)，由于重力作用，細(xì)胞在載體中下沉從孔隙中溜出而不能有效的貼附。另外支架材料的側(cè)壁有較多的空隙，細(xì)胞可以從這些空隙中溜出。因此我們用多糖生物膜采用物理包裹的方法，將支架材料從底面及側(cè)壁包裹好，可以有效減少細(xì)胞的損失。

多糖生物膜有三個(gè)特性：其一是具有可通透性，即它具有半透膜性質(zhì)水率10μL/min·cm2、分子量在2000Da的物質(zhì)可自由通過）；其二，此膜對細(xì)胞有良好的粘著力，非常適合細(xì)胞的貼壁生長；其三，此膜可吸收。為了提高載體內(nèi)外液體中大分子物質(zhì)的流通，我們用顯微穿刺的方法在膜上增加孔隙。實(shí)驗(yàn)中，我們用MTT法，檢測多糖生物膜對BMSCs的增殖及活性的影響，發(fā)現(xiàn)此膜有很好的生物相容性，不影響細(xì)胞的生長增殖，無細(xì)胞毒性。MTT比色法［7，8］，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,也是接觸法檢測材料細(xì)胞毒性的最常用的一種方法。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。

實(shí)驗(yàn)中，支架材料所在的培養(yǎng)板底外漏細(xì)胞的減少，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)較沒有包裹多糖生物膜的對照組高出35%，有效的減少種子細(xì)胞的損失；電鏡照片載體上細(xì)胞粘附情況，均反映了經(jīng)過多糖生物膜包裹的支架材料上，細(xì)胞較長時(shí)間的滯留，可以增加細(xì)胞與支架材料的粘附，及其在上面生長增殖，并驗(yàn)證了多糖生物膜在骨組織工程領(lǐng)域的作用。

【參考文獻(xiàn)】

［1］耿燕，楊朝忠.多糖生物膜細(xì)胞載體特性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.眼科研究，2003，21：501-504.

［2］王曉莉，李樹寧.多糖生物膜眼內(nèi)生物相容性［J］.眼科新進(jìn)展，2002，22:99-102.

［3］段智霞，鄭啟新.BMSCs在PLGA-【ASP-PEG】基質(zhì)材料表面粘附及殖的研究［J］.中國生物工程雜志，2006，26：86-91.

［4］Sakiyama,ElbertSE,Hubbellal.Functionalbiomaterials；designofnovelbiomaterials［J］.AnnuRevMaterRes