蛋白質(zhì)雙向電泳原理方法應(yīng)用演示文稿

蛋白質(zhì)雙向電泳原理方法應(yīng)用演示文稿本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分優(yōu)選蛋白質(zhì)雙向電泳原理方法應(yīng)用本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分第一向：等電聚焦本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分第二向：SDS—PAGE電泳聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺(Arc)和交聯(lián)劑N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速劑N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑硫酸銨（AP）或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為PAGE。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分樣品制備基本原則使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分雙向電泳樣品的溶解是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一溶解的目標(biāo)：樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液；必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分增加樣品溶解性的手段離液劑（變性劑）：通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。去垢劑（表面活性劑）：經(jīng)過(guò)離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去垢劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS應(yīng)用最普遍。還原劑：在離液劑和去垢劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過(guò)高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分聚焦時(shí)間的優(yōu)化要獲得高質(zhì)量的圖譜以及很好的試驗(yàn)重復(fù)性，所需的最佳時(shí)間即為等電聚焦達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦最佳時(shí)間由不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過(guò)度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過(guò)多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分兩維間的平衡等電聚焦電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行第二向電泳，也可于－80°保存數(shù)月。但在第二向電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而使SDS電泳能順利進(jìn)行。建議方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè)理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡(jiǎn)單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分適用于質(zhì)譜的染色方法考馬斯亮蘭（Bio-Safe?Coomassie?colloidal250stain）銀染（SilverStainPlus?stain）熒光染色（SYPRO?Rubyproteingelstain）本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分凝膠的圖像處理分析典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

樣品制備（Samplepreparation）固相預(yù)制膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）膠條的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS電泳（SDSelectrophresis）凝膠的染色及檢測(cè)（Detection/Staining）PDQuest軟件分析（Softwareanalysis）質(zhì)譜鑒定（Proteinidentification）本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分最高電壓10,000V10–25C溫度控制7,11,17,18,和

24cm的聚焦盤，可以各放12根膠條可以儲(chǔ)存10個(gè)程序，每個(gè)程序有10步程序可進(jìn)行時(shí)時(shí)編輯可供選配的打印機(jī)本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的平衡冰箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。配制膠條平衡緩沖液I。吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。第一次平衡。振蕩15分鐘。配制膠條平衡緩沖液II。第二次平衡，振蕩15分鐘。吸去玻璃板中液體。將玻璃板倒扣在桌面上。瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。配制1×電泳緩沖液。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分SDS電泳1.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。2.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/7cm），待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。3.電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分雙向電泳技術(shù)在病原微生物致病機(jī)理研究中的應(yīng)用本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分

雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展人們通過(guò)雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展。腫瘤發(fā)生的早期常常無(wú)任何癥狀，而只有在轉(zhuǎn)移時(shí)才容易被發(fā)現(xiàn)，這往往導(dǎo)致延誤了治療的最佳時(shí)期。因此找到腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行及時(shí)的診斷和治療顯得尤為重要。

本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展

雙向電泳技術(shù)的出現(xiàn)，為動(dòng)態(tài)、高通量的研究藥物作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的方法支持。雙向電泳技術(shù)的另一應(yīng)用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，可以提示藥物的毒性作用機(jī)制。細(xì)胞在施藥之后的代謝反應(yīng)做出實(shí)時(shí)的檢測(cè)，不僅能確定療效，也能針對(duì)毒性代謝物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)而對(duì)藥物進(jìn)行直接的改良，是一項(xiàng)意義深遠(yuǎn)的發(fā)現(xiàn)。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分Westernblot原理方法及應(yīng)用本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分定義印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。WesternBlot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分什么是蛋白質(zhì)印跡法？Westernblot法是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠已分離的區(qū)帶并印跡于固化紙上，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定3個(gè)階段。Westernblot法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測(cè)定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測(cè)定的方法。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分WesternBlot基本原理

WesternBlot：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分WesternBlot一般流程本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分蛋白樣品的制備本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分蛋白樣品制備的注意事項(xiàng)：細(xì)胞數(shù)量達(dá)5×106個(gè)時(shí)就可以做WB。將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液測(cè)蛋白濃度（Bca法）,統(tǒng)一上樣量加loadingBUFFER煮樣5min-10min煮沸5-15min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患?jí)結(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。有的也可以在700C加熱5-10min，尤其適用于多次跨膜蛋白的檢測(cè)（這些蛋白在煮沸狀態(tài)下容易聚集，而聚集狀態(tài)則會(huì)影響標(biāo)本進(jìn)入凝膠的效率。）本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后,由于SDS帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分凝膠成份純凈水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺（Arc-Bis）SDSTris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合）過(guò)硫酸銨(APS)（提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基）本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分轉(zhuǎn)膜膜的選擇聚偏二氟乙烯膜（PVDF）硝酸纖維素膜（NC）需要用甲醇浸泡簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價(jià)格昂貴價(jià)格便宜本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分膜的選擇本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分轉(zhuǎn)膜半干法（用恒流）將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)1h或過(guò)夜。

本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)（一）泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min

（1.凝膠若是沒(méi)在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板(黑)+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽(yáng)極碳板（白）轉(zhuǎn)膜條件： 0.4A250V1h-90min冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

（具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，反之則短。）

本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分轉(zhuǎn)膜的注意事項(xiàng)（二）避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉。夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。本文檔共61頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期六\16點(diǎn)50分封閉（1h）(封閉時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致背景過(guò)深

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