微生物檢驗操作規(guī)程

微生物檢驗操作規(guī)程1.目的建立微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證檢驗操作規(guī)化。2.圍適用于本公司相關(guān)的微生物檢驗活動的全過程。3.職責(zé)3.1微生物檢驗員負(fù)責(zé)微生物檢驗的全過程；3.2QC主管負(fù)責(zé)監(jiān)視檢查本規(guī)程的有效實施。4.操作規(guī)程4.1微生物檢驗玻璃器皿吸管的洗滌4.1.1一般的玻璃器皿〔例如培養(yǎng)皿、試管、三角瓶等〕，可用毛刷及洗滌劑洗去灰塵、油垢，然后用自來水、蒸餾水充分沖洗，直至玻璃器皿壁均勻分布一層薄的水膜，即器壁既不掛水珠也無條紋，即洗滌到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2玻璃器皿有污跡不能洗凈時，可浸泡于洗液中，待器皿中有機物氧化分解后，取出用自來水、蒸餾水沖洗干凈，備用。4.1.3新購的玻璃器皿先用2％鹽酸浸泡，再用用自來水、蒸餾水充分沖洗。4.2器皿的包扎4.2.1試管：塞上膠塞，然后用牛皮紙或報紙把試管頭包扎起來。做發(fā)酵試驗時，將試管頭塞上專用的耐高溫PVC試管帽。4.2.2三角瓶、抽濾瓶：將三角瓶〔抽濾瓶〕口塞上膠塞，然后用牛皮紙把塞頭部包起來。4.2.3吸管：將耐高溫的移液槍頭裝盒，用用牛皮紙或報紙包裹。4.2.4平皿：10個為一組，用牛皮紙包裹。4.3消毒和滅菌：4.3.1化學(xué)滅菌：此法適用于微生物操作過程中不能加熱、紫外線的地方。如人手等?！?〕用75%的乙醇溶液或0.1%新潔爾滅擦拭或浸泡。〔2〕一般用1～2%的甲醛液浸泡軟管和用具?！?〕一般成品漂白粉的有效成分是25～32%。使用時配成有效成份的2%溶液灑在地面或容器，〔對金屬有腐蝕作用〕放置10～15min后沖洗即可?！?〕氯滅菌劑的能力以有效氯表示，將氯水配制成50～100PPm的有效氯溶液，可用于浸泡，沖洗和外表殺菌。但氯對金屬有腐蝕作用。4.3.2物理滅菌：4.3.2.1干熱滅菌：適用于枯燥的玻璃器皿〔吸管、平皿等〕、金屬器具〔鑷子等〕、固體試液、液狀石蠟等。滅菌條件一般選用在160℃干熱空氣滅菌2h?！?〕器具用牛皮紙或滅菌袋包〔裝〕扎，放入金屬容器?！?〕器具在枯燥箱加熱前放入，每個器具之間留有足夠的空隙，使熱空氣能暢通。〔3〕關(guān)閉箱門接通電源，翻開通氣孔，使箱濕空氣能逸出，至箱溫度到達(dá)100℃時關(guān)閉?！?〕加熱至160℃，保持2小時?！?〕切斷電源，冷卻至60℃時，翻開箱門，取出滅菌器具，并翻開箱頂通氣口。注：滅菌時必須注意溫度不能超過180℃，以免使棉花、報紙烘焦；滅菌時不得翻開箱門；枯燥箱未冷卻時，不要取出里面器具，防止外溫差過大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。4.3.2.2濕熱滅菌：適用于容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損傷的物品。詳見"壓力蒸汽滅菌器操作規(guī)程"?！?〕裝入培養(yǎng)基的瓶用膠塞蓋上，再用牛皮紙包扎?！?〕瓶中的培養(yǎng)液不要超過1L，否則滅菌不徹底?！?〕容器的上部應(yīng)留有足夠的空間〔一般不超過裝量的2/3〕，以便產(chǎn)生氣泡。〔4〕器具用牛皮紙包裹。〔5〕器具的組合和包裹應(yīng)允許滅菌蒸汽接觸所用物品?！?〕各類器具裝入滅菌器時，相互間要留有空隙以使蒸汽自由流動。4.4無菌操作的準(zhǔn)備工作及考前須知4.4.1微生物室應(yīng)定期按"微生物實驗室管理規(guī)程"清潔。4.4.2微生物室使用前，應(yīng)先翻開紫外燈滅菌20～30min。4.4.3微生物室應(yīng)備有專用剪刀、鑷子、接種針，每次使用前后應(yīng)滅菌消毒。4.4.4微生物室應(yīng)備有75%酒精棉球；新潔爾滅消毒液浸紗布數(shù)塊，備用。4.4.5進(jìn)入微生物，換專用鞋，穿好干凈服，離室時脫去干凈服和專用鞋，干凈服和專用鞋只準(zhǔn)在微生物室使用，不準(zhǔn)穿到其它地方去，并定期洗換和消毒滅菌。4.4.6樣品檢驗前應(yīng)在原始記錄本上記錄名稱、批號等容，并在所用平皿或試管上詳細(xì)記錄樣品序號、檢驗日期等容。4.4.7無菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8操作要正確迅速，所用的器皿均應(yīng)是經(jīng)過嚴(yán)格滅菌的器皿。4.4.9檢驗完畢，立即清理工作臺，棄去不需要物品，翻開紫外燈滅菌20～30min。4.5微生物檢驗用培養(yǎng)基、溶液的配制、使用與儲存配制方法參見培養(yǎng)基說明書或檢驗標(biāo)準(zhǔn)項下規(guī)定配制。4.5.1水：電導(dǎo)率在25℃時不超過25μs/cm，除非另有規(guī)定要求。4.5.2稱重和溶解：保存培養(yǎng)基的時間需視培養(yǎng)基中水份蒸發(fā)的程度及有無污染而定，已制備好的培養(yǎng)基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培養(yǎng)基在使用前要先置于室溫30min，使其與室溫一致再使用，因為氣體的溶解度可因溫度上升而降低，特別是乳糖膽鹽發(fā)酵管的倒管會因溫度上升而出現(xiàn)氣泡，這一點必須注意。4.5.3pH的測定和調(diào)整：用pH計測pH，必要時在滅菌前進(jìn)展調(diào)整，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時，pH應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)pH±0.2圍。一般使用濃度約為40g/L〔約1mol/L〕的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L〔約1mol/L〕的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。4.5.4分裝：將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積應(yīng)比培養(yǎng)基體積最少大20%。4.5.6培養(yǎng)基的使用：經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時間，融化后防止過度加熱。融化后應(yīng)短暫置于室溫中〔如2min〕以防止玻璃瓶破碎。融化后的培養(yǎng)基放入47℃～50℃的恒溫水浴鍋中冷卻保溫，且應(yīng)盡快使用，放置時間一般不應(yīng)超過4h。未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培養(yǎng)基尤應(yīng)注意，融化后保溫時間應(yīng)盡量縮短，如有特定要求可參考指定的標(biāo)準(zhǔn)。4.5.7平板的制備和儲存傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少為3mm〔直徑90mm的平皿，通常要參加18mL～20mL瓊脂培養(yǎng)基〕。將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固。如果平板需儲存，或者培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度高于40℃，則需要傾注更多的培養(yǎng)基。凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和〔或〕5℃±3℃冰箱的密封袋中，以防止培養(yǎng)基成分的改變。在平板底部或側(cè)邊做好標(biāo)記，標(biāo)記的容包括名稱、制備日期和〔或〕有效期。也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)展標(biāo)記。將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲存期限。為了防止冷凝水的產(chǎn)生，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。儲存前不要對培養(yǎng)基外表進(jìn)展枯燥處理。對于采用外表接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應(yīng)先對瓊脂外表進(jìn)展枯燥：揭開平皿蓋，將平板倒扣于烘箱或培養(yǎng)箱中〔溫度設(shè)為25℃～50℃〕；或放在有對流的無菌凈化臺中，直到培養(yǎng)基外表的水滴消失為止。注意不要過度枯燥。商品化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。4.6檢驗方法做樣前，將滅菌好的吸管、培養(yǎng)皿等放入操作臺上，操作臺、微生物室紫外線滅菌30min，然后關(guān)紫外線滅菌燈，開啟凈風(fēng)循環(huán)30min后開場做樣。詳見附錄各檢測方法附錄1菌落總數(shù)測定附錄2霉菌和酵母計數(shù)附錄3大腸菌群計數(shù)附錄4大腸埃希氏菌計數(shù)附錄5沙門氏菌檢驗附錄6金黃色葡萄球菌檢驗附錄1菌落總數(shù)的測定方法1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3用1mL微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.4按4.6.1.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸頭。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可包括原液〕，在進(jìn)展10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液參加兩個無菌平皿作空白對照。1.6及時將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基〔可放置46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫〕傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。2.培養(yǎng)2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基外表彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂外表覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基〔約4mL〕，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按4.6.1.2.1條件進(jìn)展培養(yǎng)。2.3菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位〔CFU〕表示。2.3.1選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。2.3.2其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；假設(shè)片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。2.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。3結(jié)果與報告3.1菌落總數(shù)的計算方法3.1.1假設(shè)只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)圍，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g〔mL〕樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。3.1.2假設(shè)有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)圍時，按下式計算：式中：N——樣品中菌落數(shù)；ΣC——平板〔含適宜圍菌落數(shù)的平板〕菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度〔低稀釋倍數(shù)〕平板個數(shù)；n2——第二稀釋度〔高稀釋倍數(shù)〕平板個數(shù)；d——稀釋因子〔第一稀釋度〕。3.1.3假設(shè)所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)展計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。3.1.4假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。3.1.5假設(shè)所有稀釋度〔包括液體樣品原液〕平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。3.1.6假設(shè)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一局部小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。3.2菌落總數(shù)的報告3.2.1菌落數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入〞原則修約，以整數(shù)報告。3.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入〞原則修約后，取前2位數(shù)字后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入〞原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3.2.3假設(shè)所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。3.2.4假設(shè)空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。3.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。附錄2霉菌和酵母菌計數(shù)1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即1:10稀釋液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL無菌蒸餾水的錐形瓶〔可在瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3取1mL1:10稀釋液注入含有9mL無菌水的試管中,另換一支1mL無菌吸管反復(fù)吹吸，此液為1:100稀釋液。1.4按1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可包括原液〕，在進(jìn)展10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個無菌平皿。同時分別取1mL樣品稀釋液參加2個無菌平皿作空白對照。1.6及時將15mL～20mL冷卻至46℃的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基〔可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫〕傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。2.培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板倒置，28℃±1℃培養(yǎng)5d，觀察并記錄。3.菌落計數(shù)肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位〔CFU〕表示。選取菌落數(shù)在10CFU～150CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。4.結(jié)果與報告4.1計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算。4.1.2假設(shè)所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)展計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。4.1.3假設(shè)所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.1.4假設(shè)所有稀釋度平板均無菌生長，則以小于1乘最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于1計數(shù)。4.2報告4.2.1菌落數(shù)在100以時，按“四舍五入〞原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。4.2.2菌落數(shù)大于或等于100時，前3位數(shù)字采用“四舍五入〞原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入〞原則修約，采用兩位有效數(shù)字。4.2.3稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。A菌落總數(shù)、霉菌及酵母數(shù)檢驗流程圖附錄3大腸菌群計數(shù)第一法MPN計數(shù)1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可以選擇原液〕，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨〔LST〕肉湯，每管接種1mL〔如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯〕，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3.復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯〔BGLB〕管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。4.大腸菌群最可能數(shù)〔MPN〕的報告按3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表〔見B，表1〕，報告每g〔mL〕樣品腸菌群的MPN值。第二法平板計數(shù)法1.樣品的稀釋按第一法中的1進(jìn)展。2.平板計數(shù)2.1選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水參加無菌平皿作空白對照。2.2及時將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂〔VRBA〕約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。3.證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。4.大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以2.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g〔mL〕樣品腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g〔mL〕=6.0×105CFU/g〔mL〕。B表1大腸菌群最可能數(shù)〔MPN〕檢索表陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012＜3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100＞11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—注1：本表采用3個稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個稀釋接種3管。注2：表所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時，則表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。C大腸菌群計數(shù)檢驗流程圖第一法MPN計數(shù)法第二法平板計數(shù)法附錄4大腸埃希氏菌計數(shù)第一法MPN計數(shù)法1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min～2min,制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中〔注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面〕，換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液〔液體樣品可以選擇原液〕，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨〔LST〕肉湯，每管接種1mL〔如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯〕，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗。產(chǎn)氣者進(jìn)展復(fù)發(fā)酵試驗。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。3.復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5℃±0.2℃水浴箱。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h±2h，檢查小倒管是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)展EMB平板別離培養(yǎng)。4.伊紅美藍(lán)平板別離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。5.營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個平板上挑5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。取培養(yǎng)物進(jìn)展革蘭氏染色和生化試驗。6.鑒定取培養(yǎng)物進(jìn)展靛基質(zhì)試驗、MR〔甲基紅〕-VP試驗和檸檬酸鹽利用試驗〔詳見生化試劑盒使用〕。5.3大腸埃希氏菌MPN計數(shù)的報告大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗為＋＋――或－＋－－。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表〔見D，表2〕，報告每g〔mL〕樣品腸埃希氏菌MPN值。第二法平板計數(shù)法1.樣品稀釋按第一法中的1進(jìn)展2.平板計數(shù)2.1選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL稀釋液參加無菌平皿做空白對照。2.2將10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂〔VRBA〕傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2.3平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在10CFU～100CFU之間的平板，暗室中360nm～366nm波長紫外燈照射下，計數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。檢驗時用MUG陽性菌株〔如大腸埃希氏菌ATCC25922〕和產(chǎn)氣腸桿菌〔如ATCC13048〕做陽性和陰性對照。3.大腸埃希氏菌平板計數(shù)的報告兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報告每g〔mL〕樣品腸埃希氏菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示。假設(shè)所有稀釋度〔包括液體樣品原液〕平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。D表2大腸埃希氏菌最可能數(shù)〔MPN〕檢索表陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間0.100.010.001上限下限0.100.010.001上限下限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012＜3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100＞11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—注1：本表采用3個稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個稀釋接種3管。注2：表所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時，則表數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。E大腸埃希氏菌計數(shù)檢驗流程圖第一法MPN計數(shù)第二法平板計數(shù)法附錄5沙門氏菌檢驗1.前增菌稱取25g〔mL〕樣品放入盛有225mLBPW的容器中，均質(zhì)1min～2min。假設(shè)樣品為液態(tài)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃～5℃不超過18h解凍。2.增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。3.別離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個*LD瓊脂平板。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h〔*LD瓊脂平板〕或40h～48h〔BS瓊脂平板〕，觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表3：表3沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落形態(tài)選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。*LD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)展判定。4.生化試驗4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h。4.2用接種針挑取營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，分別接種賴氨酸和賴氨酸對照管，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，沙門氏菌屬的反響結(jié)果見表4。表4沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫酸酶試驗培養(yǎng)基的反響結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA＋〔－〕＋〔－〕＋可疑沙門氏菌屬KA＋〔－〕＋〔－〕－可疑沙門氏菌屬AA＋〔－〕＋〔－〕＋可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－－非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌注：K〔產(chǎn)堿，紅色〕；A〔產(chǎn)酸，黃色〕；產(chǎn)氣〔斷層〕；產(chǎn)硫化氫〔變黑〕＋〔陽性，〕；－〔陰性〕；＋〔－〕：多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；＋/－：陽性或陰性。4.3當(dāng)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗的初步判斷為可疑沙門氏菌屬時，用接種環(huán)挑取〔較大菌落取一半菌落，小菌落取一個〕營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，接種到3mL無菌水中，振搖制成約0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，用無菌吸管接種于沙門氏菌干制生化鑒定盒〔路橋〕的9個圓孔中，每孔0.2mL菌懸液，蓋上盒蓋，于36℃±1℃培養(yǎng)。各生化反響的培養(yǎng)及結(jié)果見表5、表6。注：將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保存24h，以備必要時復(fù)查。表5生化試劑盒〔路橋〕結(jié)果判定表試驗工程結(jié)果判定沙門氏菌生化現(xiàn)象培養(yǎng)時間說明備注陰性結(jié)果陽性結(jié)果氨基酸對照————黃色18h～24h接種后需滴加2-3滴滅菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)及外表出現(xiàn)黃色即為陰性賴氨酸脫羧酶對照管黃色對照管黃色陽性或陰性試驗管黃色試驗管紫色氰化鉀對照————生長24h～48h生長為混濁氰化鉀對照管生長對照管生長不生長試驗管不生長試驗管生長靛基質(zhì)黃色玫瑰紅色大多數(shù)陰性18h～24h培養(yǎng)后滴加2-3滴靛基質(zhì)試劑，即刻觀察。-------尿素黃色或橙色玫瑰紅色或紅色18h～24h——-------甘露醇藍(lán)色或綠色黃色陽性18h～24h——-------山梨醇大多數(shù)陽性O(shè)NPG不變色黃色陽性或陰性1h～3h和24h——-------表6沙門氏菌屬生化反響初步鑒別表反響序號硫化氫〔H2S〕靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀〔K〕賴氨酸脫羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。4.3.1反響序號A1：典型反響判定為沙門氏菌屬。如尿素、K和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常，按表7可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表7沙門氏菌屬生化反響初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀〔K〕賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果－－－甲型副傷寒沙門氏菌〔要求血清學(xué)鑒定結(jié)果〕－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ〔要求符合本群生化特性〕＋－＋沙門氏菌個別變體〔要求血清學(xué)鑒定結(jié)果〕注：＋表示陽性；－表示陰性。4.3.2反響序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)展判定。4.3.3反響序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌。大局部沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。4.5血清學(xué)鑒定4.5.1抗原的準(zhǔn)備一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的〔如2％～3％〕培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反響時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣局部取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。4.5.2多價菌體抗原〔O〕鑒定在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體〔O〕抗血清，在另一區(qū)域下部參加1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑暗背景進(jìn)展觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反響。1.6結(jié)果與報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告25g〔mL〕樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。附錄6金黃色葡萄球菌檢驗第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗1操作步驟1.1樣品的處理稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯容器中，均質(zhì)1min～2min。假設(shè)樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。1.2增菌和別離培養(yǎng)1.2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。1.2.2將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。1.2.3金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或枯燥食品中所別離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并枯燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色〔有時為白色〕，菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)展革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。1.3鑒定1.3.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。1.3.2血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再參加BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固〔即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊〕或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)展血漿凝固酶試驗。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗。1.5結(jié)果與報告1.5.1結(jié)果判定：符合1.2.3、1.3，可判定為金黃色葡萄球菌。1.5.2結(jié)果報告：在25g〔mL〕樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二法金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板計數(shù)2操作步驟2.1樣品的稀釋2.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的容器，均質(zhì)1min～2min，制成1:10的樣品勻液。2.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶〔瓶預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠〕中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。2.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注