AKTA簡(jiǎn)要操作說明

AKTA簡(jiǎn)要操作說明AKTApurifier簡(jiǎn)要操作說明口?打開儀器的主電源，打開電腦電源。待儀器自檢完畢（CU950上面的3個(gè)指示燈完全點(diǎn)亮并不閃爍）。雙擊桌面上UNICORN圖標(biāo)，進(jìn)入操作界面。:?UnicornManager文件管理、MethodEdit方法編輯、SystemControl系統(tǒng)控制、Evalution結(jié)果處理，4個(gè)窗口同時(shí)打開，同時(shí)關(guān)閉?！?UnicornManager中Manual運(yùn)行的結(jié)果自動(dòng)保存在Manualruns的文件夾中，文件名從Manualrun1~Manualrun10，第11個(gè)結(jié)果會(huì)覆蓋第1個(gè)文件（最多保存10個(gè)默認(rèn)的文件名）。如果手動(dòng)結(jié)果需要長(zhǎng)期保存，可以remove到指定文件夾或者rename?？梢岳肕anual-other-record-on（off）來選擇文件夾，制定文件名保存手動(dòng)結(jié)果?！?手動(dòng)命令前@9口@1）見《?^^系統(tǒng)手動(dòng)命令指南》□?利用脫鹽實(shí)驗(yàn)熟悉手動(dòng)操作（SystemControl^Manual）□脫鹽試驗(yàn)原理：凝膠過濾（或稱分子篩）層析是一種由限制分子通過多孔基質(zhì)，按分子大小分離混合分子的技術(shù)。蛋白質(zhì)是生物大分子，分子量比鹽等小分子大許多倍，用凝膠過濾方法為生物產(chǎn)品脫鹽十分簡(jiǎn)單、可靠。由于層析方法可透過紫外和電導(dǎo)檢測(cè)器監(jiān)控整個(gè)層析脫鹽的過程。SephadexG-25介質(zhì)用帶3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷（epichlorohydrin）交聯(lián)葡聚糖加工成珠狀的介質(zhì)。適合分子量在5000以下的生物分子的脫鹽及緩沖液置換工作。在該實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)是大分子，鹽離子是小分子，因此蛋白質(zhì)先出來（280nm有特征吸收），鹽離子后出來（電導(dǎo)值顯示）□o樣品：5mg/mLBSA,0.5MNaCl溶液10mLobindingbuffer緩沖液：去離子水o層析柱：HiTrapDesalting5mLo流速：5mL/min,口o樣品體積：200ul/0.5mL/1mL。□操作：1）準(zhǔn)備工作溶液和樣品所有的工作溶液和樣品必須經(jīng)過0.45W的濾膜過濾，使用前用低頻超聲脫氣10min。□2）清洗及管道準(zhǔn)備首先將A1管道放入bindingbuffer中，在SystemControl窗口點(diǎn)擊工具欄內(nèi)的Manual,選擇PumpfPumpwashpurifier,選中A1管道為ON,Execute。泵清洗將自動(dòng)結(jié)束。3）安裝層析柱：在Manual里選擇PumpfFlow廠@土?,輸入流速5mL/mL,Execute,讀取系統(tǒng)空壓乂Mpa（沒有安裝層析柱的系統(tǒng)壓力），選擇Alarm&monfalarmpressure,設(shè)置high@1@皿,輸入X+0.3Mpa（填料的耐受壓力，可在填料說明書中查到），Execute。Flowrate,輸入流速1mL/mL,Execute,待InjectionValve的1號(hào)位管道流出水后接入柱子的柱頭，稍微擰緊后將柱下端的堵頭卸掉接入管道連上紫外流動(dòng)池。改變Fkw「@土6,輸入流速5mL/mL,Execute4）開始純化：o選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，Alarm&monfWavelengthfUV1,UV2,UV3（可以只打開一個(gè)波長(zhǎng)口280nm）等待柱子平衡好了（觀察電導(dǎo)COND,pH的數(shù)值和變化趨勢(shì)）就準(zhǔn)備上樣了。此時(shí)將紫外調(diào)零，選擇Alarm&monfautozero,Execute。o用樣品環(huán)上（也可在平衡時(shí)將樣品推入樣品環(huán)）：將樣品吸進(jìn)注射器，推掉氣泡，從InjectionValve的3號(hào)位推入，推好后不要取下注射器。在Manual里選擇FlowpathfInjectionValvefInject,Execute。o設(shè)定收集：固定體積收集：（如果有出口閥）ManualfFlowpathfoutletvalvefF2,insert,選擇FracfMan_fractionation,輸入每管收集體積，insert,exectue。結(jié)束固定體積收集選擇Fracffractionation_stop,exectue?？诜迨占哼x擇FracfPeak_fracParametersUV_Level,設(shè)定峰收集的參數(shù)，insert,選擇FracfPeak_Man_fractionation設(shè)定峰收集每管收集的體積，insert,Execute。結(jié)束峰收集選擇FracfPeak_frac_stop,Execute。5）清洗泵及卸下層析柱：□將人1入口放入純水中，啟動(dòng)Pumpwashpurifier功能沖洗A泵和B泵及整個(gè)管路。設(shè)定Flowrate,alarmpressure,清洗柱子和管路，直至cond~0.1ms/cm,UV幾乎不變；然后再將A1和81人口放入20%乙醇中，同樣操作將乙醇沖滿整個(gè)管路保存。系統(tǒng)給柱子一個(gè)慢流速,設(shè)置系統(tǒng)保護(hù)壓力,然后先拆柱子的下端,正在滴水的時(shí)候?qū)⒍骂^擰上,再拆柱子的上端,最后擰上上端的堵頭。整個(gè)過程防止氣泡進(jìn)入。6）關(guān)閉電源：從軟件控制系統(tǒng)的第一個(gè)窗口unicornmanager點(diǎn)擊退出，其他窗口不能單獨(dú)關(guān)閉。然后關(guān)閉?KTA主機(jī)電源，關(guān)閉電腦電源?？?結(jié)果處理Evaluation1）圖形或數(shù)據(jù)拷貝、導(dǎo)出口在Unicorn軟件Evaluation界面Open結(jié)果文件口圖形拷貝：空白處f右鍵fcopytoclipboardfopenwordfpaste得到結(jié)果的圖形口在Evaluation界面，F(xiàn)ilefExportfCurves口選中206nmfSelectfExport口fExcelfilesfOK2）積分工具和柱效測(cè)定在Unicorn軟件Evaluation界面打開結(jié)果文件夾。積分：IntegratefPeakintegratef選擇待積分曲線，如：UV1_280nmfPeakwindow（調(diào)整積分區(qū)域，使其包含主峰）口fRejectPeaks（Peaksmustbeoneof1or幾個(gè)largest）fBaseline（選擇Correlatedbaseline）fColumn卜618趾：輸入實(shí)際柱高，如90cmfOKChromatogramLayoutfPeakTablefPlateheight（HETP）fAsymmrteyfOK可得到柱效（HETP）,對(duì)稱性（As）□Tip：如果峰之間沒有達(dá)到基線分離，則Baselinef選擇Calculatebaseline計(jì)算的基線fBaselinesettingsfMorphological形態(tài)學(xué)fStructurewidth（mL,在多少mL中選取比較平滑的線作為基線，該數(shù)值設(shè)置大一些）?新建柱子具體軟件操作如下：①在Unicorn軟件MethodEditor界面中選擇EditfColumnList口②新建一根自己的柱子：New口③fNewColumn中輸入柱參數(shù)：輸入Height,柱子直徑diameter；輸入其他相關(guān)參數(shù)：Vt,Vo,MaxPressure,DefaultFlowrate,MaxFlowrate等，然后SaveAs特定的柱名。這樣在ColumnList中就有了我們自己編輯好的層析柱?！?新建方法：在Unicorn軟件MethodEditor界面中選擇FilefNewfWizardfOKMainSelection層析方式選擇：Affinity、Anion/CationExchange、HIC、Sizeexclusion口fColumn：Any（或者預(yù)裝柱）fFlexibleFlowRate在不同階段用不同流速fNext口Wavelength波長(zhǎng)選擇UV：280nmfPumpInlet入口選擇fNext口Equalibration：StartConcentration%B起始濃度選擇fEqualibrationVolunme：CV平衡體積一WatchEqulibration和前一個(gè)條件是滿足任一條件，就跳入下一步。□SampleInjection：InjectionTechnique:Manual注射器上樣fEmptyLoopWith：1mL；或者SystemPumpDirectLoading系統(tǒng)泵直接上樣fInjectionVolume上樣體積（必須＞101^）,默認(rèn)樣品入口為A2（如果由0默認(rèn)82）-NextWashOutUnboundSample清洗未結(jié)合蛋白，默認(rèn)2CV（最后參數(shù)表可以修改）-FlowthroughFractionation穿透峰收集（Frac-900、OFF、OutletF3出口閥F3收集）fNextElutionFractionation洗脫收集fFrac-900收集器收集、OFF、Outlet出口閥收集-FixedVolumeFractionation固定體積收集、PeakFractionation峰收集、FixedVolumeandPeakFractionation固定體積和峰收集相結(jié)合一FractionVolume固定體積收集每管體積一Next口PeakFractionation設(shè)定峰收集-PeakIdentification-UVLevel峰高度、UVSlope紫外斜率一MinimumPeakWidth最小峰寬（排除氣泡峰）-PeakFractionationVolume-NextElution洗脫模式（根據(jù)工藝選擇一種設(shè)定）□①Isocratic等度洗脫（凝膠過濾）一LengthofElution洗脫體積一Finish口②IsocraticwithDelayedFrationation延遲峰收集的等度洗脫-LengthofElutionbeforeFractionation從0.2CV開始采進(jìn)行峰收集-LengthofElutionwithFractionation-Finish③LinearGradient線性洗脫-TargetConcentration目標(biāo)變化濃度-GradientLength梯度長(zhǎng)度（一般10~20CV）-UsecondorconcBtostartandstopFractionation利用電導(dǎo)或B%開始或者停止收集-CleanafterElutionat100B%（5CV）清洗一ReequilibrationafterElution（5CV）再平衡一Finish口?SegmentedGradientAdvanced高級(jí)梯度—GradientSegments最多可以設(shè)定9個(gè)步驟Elution?CSegment1（1）（2）-Step階段梯度\\Gradient線性-PumpInletA入口-ConcentrationB濃度-LengthofStep梯度長(zhǎng)度口FractionVolume固定體積收集-PeakFractionVolume峰收