基因芯片的制作方法

關(guān)于基因芯片的制作方法第1頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.1概述

1.基因芯片是以Southern印跡雜交技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。

反向雜交技術(shù)第2頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.基因芯片的制作方法：

原位合成法：Affymetrix公司

直接點(diǎn)樣法（合成后點(diǎn)樣）：Stanford大學(xué)，1995年第3頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三項(xiàng)目原位合成法直接點(diǎn)樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因組DNA，蛋白等探針長度約25nt不限制聯(lián)合合成需要不需要芯片表面點(diǎn)樣不需要需要密度高低制作成本高低應(yīng)用基因表達(dá)，突變檢測基因表達(dá)，突變檢測，CGH第4頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.常見的載體類型

膜

玻片

三維基質(zhì)包被玻片3.2芯片載體的制作第5頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（1）膜

優(yōu)點(diǎn)：與核酸親和力強(qiáng)。

缺點(diǎn)：單位面積上點(diǎn)樣密度低；

背景較高；

靈敏度低。第6頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（2）玻片

優(yōu)點(diǎn)：耐受高溫和高離子強(qiáng)度；

具有不浸潤性，提高點(diǎn)樣密度；背景低。

缺點(diǎn)：二維的平面結(jié)構(gòu)，與DNA雜交時(shí)會(huì)有空間位阻。第7頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（3）三維基質(zhì)包被玻片

具有三維孔性結(jié)構(gòu)，更適合做蛋白質(zhì)芯片的支持物，可以保持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，不影響它的活性。第8頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.玻片的修飾類型氨基修飾玻片同型雙功能偶聯(lián)劑修飾的玻片硫醇基修飾的玻片環(huán)氧硅烷化修飾的玻片等第9頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片羥基氨基第10頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三對苯乙異硫氰酸（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基第11頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三醛基戊二醛第12頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三連接分子手臂分子特異性探針第13頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇基修飾的玻片硫醇基第14頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片環(huán)氧硅烷基第15頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.cDNA探針2.寡核苷酸探針3.基因組DNA探針（很少用）4.RNA探針3.3探針的制備第16頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三cDNA探針：

主要來自cDNA文庫，從細(xì)胞或組織中提取RNA后逆轉(zhuǎn)。第17頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三寡核苷酸探針：

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的基因序列人工合成的。

通常在5’末端進(jìn)行氨基修飾，并加入一段不直接參與雜交的重復(fù)序列，稱為手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特異性探針第18頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三探針分子與基片表面的作用方式

化學(xué)偶聯(lián)：探針分子與基片表面活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成新的共價(jià)鍵。

物理吸附：探針分子與基片表面通過次級鍵相連接。第19頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.4點(diǎn)樣儀及點(diǎn)樣過程接觸式點(diǎn)樣非接觸式點(diǎn)樣第20頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.接觸式點(diǎn)樣

點(diǎn)樣針。

基本過程：

點(diǎn)樣針接觸探針溶液，通過浸潤現(xiàn)象或毛細(xì)現(xiàn)象，使液體轉(zhuǎn)移到針尖或針的狹縫中。針尖再接觸基片，樣品在基片上留下斑點(diǎn)，完成一次點(diǎn)樣。第21頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三點(diǎn)樣針的種類：

實(shí)心針（solidpin）裂隙針（splitpin）毛細(xì)管針（capillarytube）針與環(huán)（pinandring）第22頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三best第23頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.非接觸式點(diǎn)樣（自學(xué)）（1）微螺線閥

（2）壓電元件第25頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥1

1圖3-10當(dāng)前59家芯片設(shè)備生產(chǎn)商使用的點(diǎn)樣針分布情況（圖中的數(shù)字代表使用各點(diǎn)樣針的廠家數(shù)目）第26頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.5

原位合成法第27頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三操作平臺(tái)第28頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三Affymetrix芯片的特點(diǎn)：光導(dǎo)原位合成的寡核苷酸芯片高密度的點(diǎn)陣技術(shù)獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)

第29頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.光導(dǎo)原位合成原理第30頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.高密度的點(diǎn)陣技術(shù)1平方厘米的面積至少可排列上百萬個(gè)探針合成區(qū)（“點(diǎn)”)第31頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.Affymetrix獨(dú)特的PM-MM探針設(shè)計(jì)第32頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-11PM-MM探針設(shè)計(jì)方案第33頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三高靈敏度圖3-12僅用PM探針與聯(lián)合應(yīng)用PM-MM探針檢測靶序列的靈敏度比較第35頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠圖3-13PM-MM的多個(gè)探針的結(jié)果與單個(gè)探針的結(jié)果比較第36頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共41頁，2023年5