反相高效液相色譜法測定清益康乳膏中苦參堿的含量

反相高效液相色譜法測定清益康乳膏中苦參堿的含量【摘要】目的通過反相高效液相色譜法建立清益乳膏中苦參堿的含量測定方法。方法依利特SinoChromODSBP柱，流動相為乙腈mol/LKH2PO4溶液mol/L十二烷基硫酸鈉，流速：ml/min，檢測波長為210nm。結(jié)果苦參堿在～μg·ml-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在清益康乳膏中的平均回收率為%，RSD為%。結(jié)論該法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強、重現(xiàn)性好，可作為清益康乳膏的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】清益康乳膏；苦參堿；反相高效液相色譜；含量測定

Abstract：ObjectiveToestablishanassayofmatrineinQingyikangCreamsbyODS-BP(416mm×250mm,5μm)analyticalcolumnwasused.ThemobilephaseconsistedofAcetonitrilemol/Lmol/LSodiumDodeeyLSulfate9(20∶40∶40).Thedetectionwavelengthwas210calibrationcurveswerelinearbetween～mg·L-1(r=8).TheaveragerecoveriesofmatrineinQingyikangCreamswere%.RSDwere%(n=6).ConclusionThemethodissimple,rapid,accurateandissuitableforthedeterminationofQingykangCreams.

Keywords：QingyikangCreams;Matrine;RPHPLC;Determination

清益康乳膏由蜂膠、苦參等4味中藥制成，具有清利濕熱、止痛解毒的功效，外用主要治療帶狀皰疹等皮膚科疾病。該方原為酊劑，但由于使用不方便，且對皮膚有一定的刺激性，后改制成o/w型的乳膏。文中主要將乳膏中的主要活性成分苦參堿［1］作為主要的含測指標(biāo)。因此本實驗采用反相高效液相法來測定制劑中苦參堿的含量，結(jié)果顯示本實驗方法系統(tǒng)適應(yīng)性強，能準(zhǔn)確、快速，有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1器材

儀器日本島津LC10AT高效液相色譜儀，SPD-10A檢測器，A4800色譜工作站，7725i手動進樣閥。微孔濾膜，PHS25型精密pH計，HS3120型聲波清洗器，Elix/純水系統(tǒng)。

試劑乙腈為進口色譜純；苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品；中性氧化鋁；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純規(guī)格。藥材除蜂膠propolis購自云南昆明嵩明養(yǎng)蜂廠外，其余均購自重慶市藥材公司。乳膏樣品與陰性樣品均為自制。

2方法與結(jié)果

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：依利特SinoChromODSBP柱，流動相為乙腈mol/LKH2PO4溶液-mol/L十二烷基硫酸鈉［2］，流速：ml/min，檢測波長為210nm，理論塔板數(shù)按苦參堿峰計算，應(yīng)不低于3000；柱溫為30℃。流動相臨用前以微孔濾膜過濾并經(jīng)超聲脫氣處理。

其分離色譜見圖1。在此條件下，供試品中苦參峰與其他峰能達到基線分離，苦參堿色譜峰的保留時間約為10min。

a對照品b清益康乳膏c陰性對照1.苦參堿

圖1色譜圖

對照品溶液的制備取110℃干燥至恒重的苦參堿對照品，精密稱取苦參堿5mg，置5ml量瓶中，加無水乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備取清益康乳膏g，精密稱定，加甲醇20ml，加熱回流15min至冷，濾過，濾液蒸干后用25ml氯仿液分3次洗脫，收集洗脫液，加入濃氨水ml，混勻，密塞，穩(wěn)定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量。用氯仿補足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10ml，通過中性氧化鋁柱，依次以氯仿，氯仿-甲醇各20ml洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取苦參堿對照品溶液，，，，，ml置5ml量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻。取上述溶液10μl進樣，每個濃度重復(fù)進樣3次，按上述色譜條件測定峰面積。3次所得平均峰面積積分值與相應(yīng)的苦參堿對照品進樣量之間的回歸方程為A=1298810X+4，r=8?？鄥A進樣量在40～200μg·ml-1范圍內(nèi)與峰面積分值成線性關(guān)系。

精密度實驗精密吸取苦參堿對照品溶液，重復(fù)進樣6次，測定苦參堿峰面積，其RSD為%。

重現(xiàn)性實驗取同一批號樣品，分別稱取5份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件，依法測定苦參堿的含量。結(jié)果見表1。

表1重現(xiàn)性實驗結(jié)果

加樣回收率采用加樣回收法。精密取苦參堿對照品各適量，分別加入已知苦參堿含量的樣品中，按上述“”項下制成供試品溶液并測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2苦參堿回收率測定結(jié)果

樣品含量測定結(jié)果取5批樣品，依“”項制備樣品溶液，每批制備2份，分別精密吸取供試品溶液15μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算5批樣品的含量。結(jié)果見表3。

表3樣品中苦參堿的含量測定結(jié)果

3討論

對制劑指標(biāo)性成分的選擇苦參、蜂膠為該制劑中的兩味主藥，而蜂膠的成分復(fù)雜，除含樹脂50%～60%，蜂蠟30%外，還含300多種的黃酮類化全物［3］，因此樣品的提純步驟復(fù)雜，回收率較低，給定量分析造成了一定困難。故針對制劑所治病癥，本實驗選擇了具有抗菌、抗病毒、抗過敏等［4］作用的苦參堿為制劑檢測的主要指標(biāo)性成分。

對苦參堿含量測定方法的選擇目前對苦參堿含量測定的文獻報道主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等［5，6］，其中2005版《中國藥典》里對苦參的含量測定主要是以氨基鍵合硅膠為填充柱來分析喹喏里西啶類生物堿，此法雖然分離效果較好，但實驗操作較繁瑣，樣品須經(jīng)固相萃取凈化；另外薄層掃描法是一種離線技術(shù)，其各步操作基本上是在開放體系中進行，因此，影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜，準(zhǔn)確較差［7］，因此為了有效控制制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合現(xiàn)有的試驗條件，本實驗應(yīng)用RP-HPLC法來測定樣品中苦參堿的含量。

苦參堿選擇波長的確定2005版《中國藥典》中，HPLC法測定苦參堿和氧化苦參堿的檢測波長在220nm處［8］，但本實驗取苦參堿的對照品溶液，于200～500nm波長內(nèi)掃描，結(jié)果苦參堿乙醇液在210nm有最大吸收，流動相中無水乙醇的紫外線吸收干擾小，基線穩(wěn)定，因此選擇210nm為檢測波長。

提取方法的考察樣品的預(yù)處理比較酸提堿沉和濃氨水堿化氯仿提取的方法，結(jié)果前者操作繁瑣，提取效果不如后者。試驗中還發(fā)現(xiàn)在制備供試液時，為了能使中藥的有效成分與多種乳膏基質(zhì)很好分離，最好采用甲醇回流使乳膏破乳，待濾液充分冷卻后再過濾的方法，這樣就能較好的去除乳劑基質(zhì)對含測成分的干擾。

流動相的選擇本文流動相的選擇主要是在原清益康酊劑含量測定方法的基礎(chǔ)上進一步修改完善而成，因原方法主要采用薄層-高效液相色譜［9］，經(jīng)過對幾個流動相分離樣品效果的比較，結(jié)果還是以本實驗的流動相取得的效果較滿意，因為乙腈的紫外末端吸收較小，而苦參堿也為紫外末端吸收，故采用乙腈作為流動相的系統(tǒng)組成；而與純水流動相相比，采用磷酸鹽-SDS離子對的流動相，不僅可以使樣品在非極性固定相中的溶解度增大，分配系數(shù)增加，有效避免其他生物堿成分的干擾，而且能使分離成分的色譜峰形狀發(fā)生變化，保留時間延長。

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