柿葉總黃酮提取工藝的研究

柿葉總黃酮提取工藝的研究【摘要】目的對(duì)柿葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。方法采用正交實(shí)驗(yàn)法，以總黃酮含量為指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、溶劑量及提取次數(shù)和時(shí)間３種因素進(jìn)行了研究。結(jié)果將柿葉最粗粉用２５倍８０％乙醇提?。创?，可以獲得較高的提取率。結(jié)論此工藝有效成分提取率較高，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可行。

【關(guān)鍵詞】柿葉總黃酮正交實(shí)驗(yàn)提取工藝

Abstract:ObjectiveＴｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｉｎＰｅｒｓｉｍｍｏｎＬｅａｖｅｓ．MethodsＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｖｏｌｕｍｅｏｆａｌｃｏｈｏｌ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗｅｒｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｓｔｕｄｉｅｄｂｙｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓａｓｔｈｅｍａｒｋｅｒ．ResultsＴｈｅｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｗａｙｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｗａｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ２５ｔｉｍｅｓａｍｏｕｎｔｏｆ８０％ａｌｃｏｈｏｌｕｎｄｅｒｒｅｆｌｕｘｆｏｒ４ｔｉｍｅｓ．ConclusionＴｈｉｓｍｅｔｈｏｄｏｂｔａｉｎｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｉｔｉｓｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ．

Keywords:Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎｌｅａｖｅｓ；Ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ

柿樹是我國(guó)的重要樹種之一，柿葉為柿樹科落葉喬木植物柿DiospyroskakiＬ．ｆ．的新鮮或干燥葉片。國(guó)內(nèi)外研究表明，柿葉制劑、柿葉茶及柿葉提取物具有降壓、利尿、抑菌、止血、降脂、抑制癌瘤生長(zhǎng)等多方面的生理活性。研究表明，柿葉中的主要有效成分為黃酮類，大多以苷的形式存在［１］，其具有抗急性腦缺血損傷神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)心血管系統(tǒng)有增加冠脈流量、降低血壓、降低心肌耗氧量、改善全身血液循環(huán)作用，能增加小鼠對(duì)窒息性缺氧的耐力，并對(duì)大鼠急性心肌缺血有一定的保護(hù)作用。此外，柿葉黃酮還有抗氧化清除自由基、抗過(guò)敏、保肝［2］、抗炎、抗菌、抗腫瘤等功能，在防治中老年人腦動(dòng)脈硬化、預(yù)防腦血栓形成、防治老年人癡呆和其它神經(jīng)退行性疾病、皮膚抗衰老、美容等方面有廣泛的開發(fā)前景［3］。為了有效利用柿葉所含的黃酮類物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了總黃酮最佳提取條件。

1儀器與試藥

１．１儀器ＵＶ－２２０１紫外可見分光光度計(jì)；傾斜式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；ＰＢ２０３－Ｎ電子精密天平；ＡＪ１５０Ｌ電子精密天平。

１．２試藥實(shí)驗(yàn)用藥材采自北京市昌平區(qū)，落葉晾干，經(jīng)鑒定為柿樹科柿屬柿DiospyrosKakiＬ．ｆ．；蘆丁對(duì)照品；ＡｌＣｌ３·６Ｈ２Ｏ等均為分析純。

2方法與結(jié)果

２．１因素水平表乙醇作為提取溶劑，對(duì)乙醇濃度、溶劑量及提取次數(shù)和時(shí)間３種因素進(jìn)行考察，每種因素分為３個(gè)水平，結(jié)果見表１。

供試品溶液的制備精密稱取柿葉最粗粉１ｇ共９份，按照表２Ｌ９正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，用對(duì)應(yīng)濃度和體積的乙醇回流提取相應(yīng)次數(shù)和時(shí)間。回流結(jié)束后合并提取液，放冷，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至１００ｍｌ或２００ｍｌ量瓶中，分別以其相應(yīng)的提取溶劑定容，過(guò)微孔濾膜，作為供試品溶液。

表1正交設(shè)計(jì)因素水平

表2L9正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

對(duì)照品溶液的制備精密稱取１２０℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品０．０８２５ｇ于１００ｍｌ量瓶中，７０％乙醇超聲溶解，定容至刻度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液０．８２５ｍｇ·ｍｌ－１。

顯色試劑及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇Ａｌ３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ顯色法［４］：精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液０．５ｍｌ和供試液１＃、４＃、７＃各適量至２５ｍｌ量瓶中，分別加入５％ＮａＮＯ２１．０ｍｌ，放置６ｍｉｎ，然后加入１０％Ａｌ３１．０ｍｌ，混勻，放置６ｍｉｎ，再加入４．３％ＮａＯＨ１０ｍｌ，用７０％乙醇定容至刻度，放置１５ｍｉｎ。在１９０～７００ｎｍ范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸收光譜。

ＡｌＣｌ３顯色法［５］：精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液０．１ｍｌ和供試液１＃、４＃、７＃各適量至１０ｍｌ量瓶中，分別加入０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３·６Ｈ２Ｏ１．０ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度，搖勻，放置１５ｍｉｎ。在１９０～７００ｎｍ范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸收光譜。

比較上述兩種顯色法，用Ａｌ３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ顯色后，明顯生成紅色絮狀沉淀，此法不宜采用；而ＡｌＣｌ３顯色后，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的λｍａｘ＝４１０ｎｍ，３個(gè)樣品溶液的λｍａｘ＝４００～４１０ｎｍ，故選擇ＡｌＣｌ３顯色后４１０ｎｍ測(cè)定吸光度。

顯色穩(wěn)定性考察精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液０．３ｍｌ和供試液４＃１．０ｍｌ，依法顯色后放置不同時(shí)間，測(cè)定吸光度，結(jié)果見表３，吸光度RSD分別為０．２％和０．３％，可見蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和供試液４＃顯色后４ｈ內(nèi)基本穩(wěn)定。

線性關(guān)系考察取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液１．０ｍｌ置２５ｍｌ容量瓶中，用５０％乙醇定容至刻度，搖勻，分別?。保?，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０ｍｌ置１０ｍｌ量瓶中，加入０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３·６Ｈ２Ｏ１．０ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度搖勻，４０ｍｉｎ后于４１０ｎｍ處測(cè)定吸光度Ａ值，結(jié)果見表４。線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A＝５．６×１０－３C＋５．７×１０－３，R＝０．９９９９，線性范圍為３３．０～１３２．０μｇ／ｍｌ。

樣品測(cè)定分別?。狗莨┰嚻啡芤哼m量至１０ｍｌ量瓶中，加０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３·６Ｈ２Ｏ１．０ｍｌ，用５０％乙醇定容至刻度，搖勻，４０ｍｉｎ后于４１０ｎｍ處測(cè)定吸光度Ａ值，換算為總黃酮含量，如表２所示，極差分析得最佳提取工藝為Ａ２Ｂ２Ｃ３，即８０％乙醇，２５倍量，提?。创巍?/p>

表3顯色穩(wěn)定性考察

表4蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱取柿葉最粗粉１ｇ５份，置于１００ｍｌ錐形瓶中，按照Ａ２Ｂ２Ｃ３條件提取，合并提取液，放冷，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至２００ｍｌ量瓶中，８０％乙醇定容至刻度，過(guò)微孔濾膜，測(cè)定樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見表５，其平均值為１０１．８２１ｍｇ·ｇ－１，RSD＝２．１％，表明此條件重復(fù)性良好。

表5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論與討論

結(jié)論柿葉乙醇提取最佳工藝為Ａ２Ｂ２Ｃ３，即８０％乙醇，２５倍量，提?。创巍ＷC樣品中總黃酮平均含量為１０１．８２１ｍｇ·ｇ－１，表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)采用同一方法測(cè)定柿葉水提物和乙醇提取物中總黃酮含量，結(jié)果前者顯著低于后者，根據(jù)參考文獻(xiàn)及上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用乙醇作為提取溶劑。

ＡｌＣｌ３顯色方法與參考文獻(xiàn)比較未采用７０℃水浴，因?yàn)閷?shí)際測(cè)定兩者差異不大，不采用水浴可以減少測(cè)定步驟，減小誤差。

預(yù)實(shí)驗(yàn)采用２２～４８目柿葉粉回流提取，發(fā)現(xiàn)有爆沸現(xiàn)象，改為最粗粉１０～２２目。

【參考文獻(xiàn)】

［1］郭玫，董曉萍，徐文萍．柿葉的研究概況［Ｊ］．甘肅中院學(xué)報(bào)，２０００，１７：７８．

［2］譚仁祥．植物成分分析［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，２００２：４８６