毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌定量研究

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌定量研究【摘要】目的：定量研究毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌以滿足臨床診斷要求。方法：用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法對(duì)ATCC25922進(jìn)行分離，研究其峰高與量的關(guān)系。結(jié)果：毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離ATCC25922濃度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之間線性很好，其峰高與濃度關(guān)系符合線性方程：㏑mAU＝﹣＋×㏑C,R2＝1。結(jié)論：CZE法分離大腸埃希菌可進(jìn)行定量研究。

【關(guān)鍵詞】毛細(xì)管區(qū)帶電泳；分離；大腸埃希菌

[Abstract]Objective:AquantitativestudyaboutdeterminationofEscherichiacolibycapillaryzoneelectrophoresiswastomeettheclinicdiagnosisrequest.Methods:WedeterminedATCC25922byCZEandstudiedthelinearrelationshipbetweenthepeakheight(mAU)andtheEscherichiacoliconcentration(C).Results:ThelinearrelationshipofATCC25922concentrationdeterminedbyCZEbetween105cfu/mland5×107cfu/mlwasquitegood.Regressionlineequationis㏑mAU＝﹣＋×㏑C,R2＝:EscherichiacoliATCC25922determinedbycapillaryzoneelectrophoresiscouldbeusedforaquantitativestudy.

[Keywords]Capillaryzoneelectrophoresis；Separation；Escherichiacoli大腸埃希菌是臨床常見感染菌之一，由其引起的泌尿系統(tǒng)感染占%[1]，其診斷主要靠細(xì)菌培養(yǎng)法定量分析，但該法耗時(shí)較長(zhǎng)。毛細(xì)管區(qū)帶電泳是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種高效分離技術(shù)，具有快速、靈敏、低耗等優(yōu)點(diǎn)，可用于研究多種細(xì)菌的分離。毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌ATCC25922定量研究，將有利于快速診斷，滿足臨床要求。

1材料和方法

儀器Beckman-CouletP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳儀和UV檢測(cè)器,河北永年銳灃色譜器件公司未涂層石英硅毛細(xì)管，上海天達(dá)pHS-3TCpH計(jì)。

試劑和菌株來源聚氧化乙烯、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司)，硼酸、氫氧化鈉、鹽酸，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸餾水。采用上述材料配制TBE貯存緩沖液，將其1∶16稀釋，添加終濃度為%的PEO(Mn600000)，并用/LNaOH和鹽酸調(diào)整pH至，作為電泳緩沖液待用。ATCC25922。

方法

電泳方法采用內(nèi)徑75μm、有效長(zhǎng)度為40cm的石英毛細(xì)管，陽極壓力進(jìn)樣20s，電壓25kV，電泳時(shí)間15min，25℃恒溫，陰極檢測(cè)，波長(zhǎng)214nm。開機(jī)后及每一份標(biāo)本檢測(cè)前依次用/L氫氧化鈉、雙蒸餾水、電泳緩沖液20psi沖洗毛細(xì)管5min。

檢測(cè)方法將血瓊脂平板上經(jīng)35℃，18~24h培養(yǎng)的ATCC25922的菌落挑于電泳緩沖液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，靜置30min后進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSSforwindows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

CZE分離定量電泳圖在相同條件下，應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離濃度為5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大腸埃希菌,譜峰高度分別為316、61、、和mAU，峰形尖銳，分離效率高。電泳圖譜見圖1。

CZE分離峰高與濃度的線性關(guān)系根據(jù)5次定量試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)大腸埃希菌濃度和相應(yīng)檢測(cè)的峰高分別取對(duì)數(shù)，以㏑C為橫坐標(biāo)，㏑mAU為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，線性方程為：㏑mAU＝-＋×㏑C,R2＝1。

3討論

細(xì)菌為膠體顆粒，比表面積極大，且覆蓋著多糖類、肽聚糖、脂類等物質(zhì)，這些化合物在電泳緩沖液中可因解離和吸附形成雙電層；因而，毛細(xì)管區(qū)帶電泳將細(xì)菌當(dāng)作“離子”看待，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，在電滲流作用下達(dá)到高效聚焦和分離[3，4]。毛細(xì)管區(qū)帶電泳法已成功分離了多種細(xì)菌，并取得非常高的分離峰效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌ATCC25922通常保持較高的存活率，極易聚集出現(xiàn)雜峰，影響分離度。消除聚集可在電泳前使大腸埃希菌與運(yùn)行緩沖液充分混勻后靜置30min以利于緩沖液和添加劑充分與大腸埃希菌作用，形成相對(duì)穩(wěn)定的單個(gè)離子減小聚集。

本研究顯示毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌濃度在105～5×107cfu/ml時(shí)定量實(shí)驗(yàn)敏感性好、分離效率高，峰高與大腸埃希菌濃度的線性關(guān)系較好，可依據(jù)峰高用回歸方程分析大腸埃希菌濃度,回歸方程：㏑mAU＝-＋×㏑C,R2＝1；對(duì)于菌量105cfu/ml，本試驗(yàn)可將菌液進(jìn)行10倍濃縮，提高濃度后檢測(cè)。

隨著毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)自動(dòng)化操作的實(shí)現(xiàn)，利用其快速、高效、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為臨床快速、批量分離和分析微生物提供了一個(gè)很好的選擇性手段。盡管毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析微生物還存在著一些亟待解決的問題，但本研究顯示經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，其在微生物的分離和分析中可以得到很好的結(jié)果；毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離大腸埃希菌，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、溶劑消耗少、環(huán)境污染小，具有較高的研究?jī)r(jià)值和前景。

【參考文獻(xiàn)】

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