蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法實驗室規(guī)則考勤實驗操作實驗室安全（儀器、藥品、水、電等）值日（桌面、地面、門、窗、水、電等）考試蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法①實驗名稱②實驗?zāi)康蘑蹖嶒炘恚ê喪?④實驗材料、儀器及其試劑⑤實驗方法與操作步驟（工藝流程圖或表格方式）⑥實驗結(jié)果及分析（實驗現(xiàn)象或?qū)嶒灲Y(jié)果數(shù)據(jù)整理、歸納、分析和對比）⑦討論（實驗方法、操作步驟、實驗正(異)常結(jié)果、建議等）標準的實驗報告應(yīng)該簡潔明了地給出使別人能夠重復(fù)你的實驗所需要的全部信息。

關(guān)于實驗報告:

要用自己的實驗記錄認真地寫出一份實驗報告，不得互相抄襲。實驗報告的內(nèi)容:蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法蛋白質(zhì)（protein）：是由α-氨基酸按一定序列通過肽鍵縮合而成的具有一定功能的生物大分子。蛋白質(zhì)的組成單位：氨基酸。蛋白質(zhì)的元素組成元素CHONSP其他百分比50-556-720-23160-30-3蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法根據(jù)功能不同，蛋白質(zhì)可分為：1、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)：建造和維持生物體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；2、酶：具有催化功能的蛋白質(zhì)；3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)：具有調(diào)控功能的蛋白質(zhì)；4、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

1、學(xué)習(xí)利用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量的原理及方法；

2、掌握分光光度計的使用方法；

3、掌握標準曲線的繪制。

一、實驗?zāi)康模旱鞍踪|(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中游離狀態(tài)下為棕紅色。當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合后變?yōu)樗{色.

蛋白質(zhì)染料復(fù)合物對595nm可見光有最大光吸收.

在一定范圍內(nèi)（10-1000ug/ml）其OD595nm值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用分光光度法進行蛋白質(zhì)的定量測定。二、實驗原理：蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法考馬斯亮藍G-250染色法原理465nm595nm酸性環(huán)境下呈棕紅色與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍色加入蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法雙縮脲反應(yīng)：Folin-酚試劑法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凱式定氮法：其他蛋白質(zhì)含量的測定方法蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（1）雙縮脲法：

原理是蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，故可以用來測定蛋白質(zhì)含量.幾種其他蛋白質(zhì)含量的測定方法蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（2）Folin-酚試劑法（Lowry法）：

是雙縮脲法的發(fā)展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個復(fù)合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，產(chǎn)生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）比雙縮脲法靈敏，但費時；蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（3）紫外吸收法：

蛋白質(zhì)中Trp，Phe，Tyr的殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，吸收高峰在280nm處，所以蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，并且蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量成正比，可用作定量測定。簡單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類不干擾。

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（4）微量凱式定氮法：

根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，因此，測得1g蛋白氮，相當(dāng)于蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

1、實驗材料：綠豆芽、小麥種子、葡萄、蘋果

2、儀器：(1)S-22pc可見光分光光度計(2)研缽

(3)離心機(4)試管(5)容量瓶等

3、試劑：（1）染色液：考馬斯亮藍G-250

(100mg考馬斯亮藍溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀釋至1L)（2）濃度：的牛血清白蛋白標準溶液。三、實驗材料、儀器和試劑：蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法1、制作標準曲線：

取7支試管，依次分別加入，的牛血清蛋白溶液，用水補足到，每管均再加5ml染色液，立即搖勻，置室溫下放置5分鐘。然后測各管的OD595nm值，繪制標準曲線。四、實驗步驟：

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法標準曲線的繪制目的：得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。首先，用一組已知濃度的蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍G-250反應(yīng),然后在595nm處測定吸光度（OD）。其次，繪制濃度與吸光度對應(yīng)的曲線圖。最后，測定樣品蛋白質(zhì)的吸光度然后在曲線上找到對應(yīng)的濃度。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法1、制作標準曲線：

編號1(空白）234567樣品標準蛋白

(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml

水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值四、實驗步驟：蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法標準蛋白質(zhì)濃度OD值0樣品OD值C00.050.0750.1

0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6

標準曲線的制作（圖）y=ax+bR2=蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

稱取豆芽葉片1g→研缽中加2ml水→研成勻漿→轉(zhuǎn)入離心管→用水分三次沖洗研缽，每次2ml→均轉(zhuǎn)入同一離心管→等重后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘→取上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶→定容。2、樣品蛋白質(zhì)提取：蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

取提取液于試管中,加入考馬斯亮藍G-250染色液5ml，充分混勻，放置5分鐘，以制作標準曲線的1號試管為參比溶液，調(diào)吸光度為“0”，測豆芽提取液的吸光度A595nm，記錄結(jié)果，查標準曲線，得蛋白質(zhì)濃度X(mg/ml)。3、測定：蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法五、結(jié)果計算：

樣品蛋白質(zhì)含量（mg/g）

=[C0·提取液的總體積]/樣品鮮重(g)蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法分光光度技術(shù)

利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計.

紅外吸收光譜：波長范圍1000m,主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。紫外吸收光譜：波長范圍200400nm（近紫外區(qū)）可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析?？梢娢展庾V：波長范圍400750nm，主要用于溶液等的定量分析。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

光吸收定律：朗伯—比爾(Lambert-bee)光吸收定律：A＝lg（I0/It)＝-lgT＝εbc（1）A—吸光度“OD”：描述溶液對光的吸收程度；同一種溶液對不同波長光的吸光度是不相同的，在吸光度最大處所對應(yīng)的波長稱為最大光吸收處。同一種物質(zhì)不同濃度的吸光度，在某一定波長下有差異，在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進行物質(zhì)定量分析的重要依據(jù)。I0：表示入射光強度，It：表示光線通過溶液后的強度。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（2）T—透光度：描述入射光透過溶液的程度；

（3）ε—摩爾吸光系數(shù)(是溶液的特征常數(shù))，在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；單位mol·L－1；（4）b—樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，b=1cm（5）C—樣品濃度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD與物質(zhì)的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A＝lg（I0/It)=-lgT＝εbc

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

分光光度計的組成和構(gòu)造：（1）光源；（2）單色器（3）吸收池；（4）接收檢測放大系統(tǒng)(檢測器)；（5）信號指示系統(tǒng)(顯示或記錄器)。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法

⑴光源：

用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢

，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），適用波長范圍是320～1100nm。用于紫外光區(qū)的是氫燈和氘燈適用波長范圍是195～400nm。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法⑵單色器：單色器是分光光度計的心臟部分。把來自光源的混合光波分解為單一波長的光能隨意改變光的波長。單色器一般由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法⑶吸收池吸收池（即比色杯）：用來盛裝被測試的溶液。光學(xué)比色杯和石英比色杯兩種。光學(xué)比色杯適用波長范圍是400nm～2000nm，只能用于可見光。石英比色杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm～3000nm。光程可由至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml）蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法吸收池使用注意事項：①比色杯在使用前后都要徹底的清洗。②嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。③嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。④嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法⑷檢測器：檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等。

⑸顯示裝置：分光光度計現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機。高性能分光光度計均可以連接微機，而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機，有的還帶有標準軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素。蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會引起對Beer-Lambert定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色方法(2)化學(xué)性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時，溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、互變異構(gòu)、配合物的形成和與溶劑間的作用，使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋

=