第13章生物技術(shù)應(yīng)用在園藝植物育種中應(yīng)用

第13章生物技術(shù)應(yīng)用在園藝植物育種中應(yīng)用13.1.1花藥與花粉培養(yǎng)技術(shù)1）花藥培養(yǎng)（1）材料的選取植物材料的基因型、生長(zhǎng)情況及接種時(shí)花粉所處的發(fā)育時(shí)期對(duì)花藥培養(yǎng)有直接影響。從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育，對(duì)多數(shù)植物而言，最佳時(shí)期是單核中期至晚期。各種植物花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是不同的，可根據(jù)花藥內(nèi)花粉發(fā)育期與花蕾大小、外觀形態(tài)、色澤的相關(guān)性來選取材料。一般采用涂片法來確定花粉發(fā)育的時(shí)期，用醋酸洋紅或卡寶品紅或鐵釩-蘇木精染色后找出小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)與該種植物花蕾發(fā)育形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)性，便于接種取材。（2）材料預(yù)處理與滅菌在大多數(shù)情況下，只有經(jīng)過預(yù)處理的花藥才能培養(yǎng)出完整的單倍體植株。預(yù)處理的方法有低溫、高溫、離心和預(yù)培養(yǎng)等，目的是要從形態(tài)上改變其極性分布，從生理生化上改變其細(xì)胞生理狀態(tài)，以改變其分裂方式和發(fā)育途徑。經(jīng)預(yù)處理后的花蕾，用乙醇進(jìn)行表面滅菌后再用次氯酸鈉或升汞滅菌后即可接種。（3）接種培養(yǎng)消毒后的花蕾在無菌條件下，用鑷子剝?nèi)セò?，取花藥接種于MS、N6、Nitsch等基本培養(yǎng)基上，并將花絲、空癟及受傷花藥剔除。培養(yǎng)溫度因不同植物而異，一般在25～28℃之間。2）花粉培養(yǎng)（1）花藥預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)預(yù)處理方法有黑暗處理、光質(zhì)處理、高滲處理、藥物處理及溫度處理等。多采用的是，取花粉處于合適發(fā)育期的花蕾，置于4～10℃下處理1～15天?；ㄋ庮A(yù)培養(yǎng)也是行之有效的方法，具體是滅菌后的花藥置于甘露醇溶液中，漂浮預(yù)培養(yǎng)2～5天，取出花藥后再分離花粉培養(yǎng)；也可在無菌條件下取出花藥，接種于Nitsch等培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)數(shù)天，然后將花粉分離出來，再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，小孢子可啟動(dòng)發(fā)育。（2）花粉的分離分離小孢子的方法有擠壓法、散落法和器械法三種。無論采用哪種方法，均需得到一定量的小孢子，且無菌、無雜質(zhì)，成活率高，發(fā)育整齊等。所謂擠壓法就是用玻璃棒在燒杯壁上擠壓花藥，使花粉從花藥中釋放出來。散落法是把花藥接種于液體培養(yǎng)基上，懸浮培養(yǎng)1～7天，花藥自然開裂，散出花粉，及時(shí)取出花藥壁，留下花粉繼續(xù)培養(yǎng)。器械法是用小型攪拌器或超速旋切機(jī)來分離小孢子。（3）培養(yǎng)方法常用懸滴培養(yǎng)和液體淺層培養(yǎng)。懸滴培養(yǎng)時(shí)，每滴可接種50～80粒花粉；液體淺層培養(yǎng)用直徑5cm的培養(yǎng)皿，加花粉懸浮液，花粉密度為每毫升104～105個(gè)。13.1.2未受粉胚珠和子房培養(yǎng)1）未授粉胚珠培養(yǎng)（1）材料的選擇胚囊發(fā)育時(shí)期是未授粉胚珠培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵?？筛鶕?jù)花的外部形態(tài)特征來切取合適發(fā)育期的胚囊。此外，在接種前經(jīng)低溫預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)后也可得到較好的效果，如向日葵將其花序在10℃預(yù)處理一周，可提高誘導(dǎo)率。（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件應(yīng)用較多的基本培養(yǎng)基有White、Nitsch、MS和N6等。一般情況下，培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為3～12%，多數(shù)為5%。大多數(shù)植物胚珠培養(yǎng)溫度要求在25℃左右，但不同植物之間也有所差異。2）未授粉子房培養(yǎng)（1）材料的選擇接種時(shí)胚囊所處的發(fā)育階段對(duì)子房培養(yǎng)的成敗起著關(guān)鍵性作用。有的可根據(jù)開花前的天數(shù)、未開放花蕾長(zhǎng)度來選擇子房進(jìn)行培養(yǎng)，但更多的是根據(jù)胚囊發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性來選擇較準(zhǔn)確的培養(yǎng)時(shí)期，接近成熟的胚囊較容易誘導(dǎo)成功。（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件常用的基本培養(yǎng)基有MS、N6和BN等，蔗糖質(zhì)量濃度多為3%～10%之間，激素種類及配比因不同材料而異。13.1.3離體受精

所謂離體受精也稱離體授粉，就是把未授粉的胚珠或子房從母體上切離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，并以一定的方式授以無菌的花粉，使之在試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，可使花粉不經(jīng)柱頭和花柱組織而直接進(jìn)入子房中的胚珠，有可能克服孢子體不親和，從而得到遠(yuǎn)緣雜種。此外，這項(xiàng)技術(shù)也為外源特異基因的有性轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化開辟了廣闊的應(yīng)用前景。1）離體子房受精離體子房受精就是將不同發(fā)育階段的子房連同一段花梗，經(jīng)消毒后，接種在培養(yǎng)基上，再授以無菌的花粉?；ǚ劭梢杂貌煌瑵舛鹊呐鹚帷⒄崽桥涑苫ǚ蹜腋∫?，在子房上切一個(gè)開口，把花粉懸浮液滴入切口中，也可用注射器直接把花粉懸浮液注入子房?jī)?nèi)，最后將子房接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。此技術(shù)是一種接近于自然情況的授粉技術(shù)。2）胚珠試管受精為了提高胚珠培養(yǎng)的成活率，通常選用帶有胎座的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)。胚珠包裹在子房?jī)?nèi)，處于無菌狀態(tài)，只需子房消毒后直接在無菌條件下把胚珠剝離出來接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。授粉時(shí)可以直接把無菌的花粉撒在胚珠上，也可先將花粉撒在培養(yǎng)基上，然后把帶有胎座的胚珠接種在散播花粉的培養(yǎng)基上進(jìn)行授粉。13.1.4胚培養(yǎng)雜種胚由于營養(yǎng)或生理的不協(xié)調(diào)而導(dǎo)致難以播種成苗，或在發(fā)育早期就敗育或退化，把雜種胚在敗育或退化之前直接剝離出來接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行早期離體培養(yǎng)的方式叫做雜種胚挽救。離體胚培養(yǎng)可以克服種間乃至屬間受精障礙、打破種子休眠、縮短育種周期、克服種子生活力低下和自然不育等，通過成熟胚和未成熟胚離體培養(yǎng)已獲得了不少的園藝植物。1）成熟胚培養(yǎng)（1）成熟胚培養(yǎng)的意義（2）材料的消毒與接種（3）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件2）原胚培養(yǎng)（1）原胚培養(yǎng)的概念及意義（2）材料的選擇（3）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件13.1.5胚乳培養(yǎng)（1）胚乳發(fā)育期的選擇（2）胚乳愈傷組織的建立（3）培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件13.1.6原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合1）原生質(zhì)體分離（1）植物材料的滅菌與處理（2）酶液處理（3）原生質(zhì)體的收集與純化2）原生質(zhì)體培養(yǎng)（1）液體培養(yǎng)（2）培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)均可，應(yīng)注意原生質(zhì)體的濕度及培養(yǎng)的溫度和光照。3）原生質(zhì)體融合（1）原生質(zhì)體融合的概念及意義（2）原生質(zhì)體融合的方法常用的方法有聚乙二醇法（PEG法）、電融合法、高pH-高濃度鈣離子法和NaNO3等。（3）雜種細(xì)胞的選擇雜種細(xì)胞選擇的方法概括起來有兩種，一種是利用物理方法進(jìn)行選擇，另一種是利用雜種細(xì)胞的生長(zhǎng)特性或突變體互補(bǔ)進(jìn)行選擇。（4）體細(xì)胞雜種植株的再生及鑒定形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定生化鑒定DNA檢測(cè)鑒定13.1.7體細(xì)胞無性系變異植物細(xì)胞、組織、器官在無菌條件下進(jìn)行離體人工培養(yǎng)，經(jīng)過脫分化和再分化的過程，重新形成愈傷組織和完整植株稱為體細(xì)胞無性系。在培養(yǎng)階段發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致再生植株也發(fā)生遺傳改變的現(xiàn)象，稱為體細(xì)胞無性系變異。無性系變異在園藝植物離體培養(yǎng)中普遍存在，由于很多園藝植物都是無性繁殖的，發(fā)現(xiàn)無性系變異后，很快就能通過無性繁殖固定下來，所以無性系變異的研究在園藝植物上更為活躍，在育種上的應(yīng)用成果相對(duì)也較多。（1）突變體的產(chǎn)生（2）突變細(xì)胞的篩選方法（3）突變性狀的穩(wěn)定性鑒定13.1.8植物快繁技術(shù)（1）離體快繁技術(shù)體系的建立（2）植物快繁技術(shù)的應(yīng)用13.2基因工程與育種植物基因工程是指按照人們的意愿進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，經(jīng)體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造植物種性，使現(xiàn)有物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新種質(zhì)的過程。它是近30年來隨著DNA重組技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而興起的生物技術(shù)。自1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，植物基因工程的研究進(jìn)展迅速。迄今為止，國內(nèi)外已得到60種以上轉(zhuǎn)基因植物，其中玉米、棉花、馬鈴薯、煙草和大豆等已大面積種植。13.2.1基因工程的基本原理與技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)大致可劃分為兩類：一類是載體介導(dǎo)法，即利用另一種生物來實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)入和整合，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法等；另一類是DNA直接攝取法，即將裸露的DNA通過物理或化學(xué)的方法直接轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，如基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法、花粉管通道法、電擊法、顯微注射法、超聲波導(dǎo)入法等。目前較常用的幾種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法及花粉管通道法。1）基因工程的基本要素（1）外源DNA（2）受體細(xì)胞（3）載體分子（4）工具酶①限制性核酸內(nèi)切酶。②DNA聚合酶。③連接酶④反轉(zhuǎn)錄酶。2）植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)（1）目的基因的分離與鑒定①鳥槍法。②轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。③T-DNA插入突變法④基因圖譜克隆法。⑤PCR擴(kuò)增法。（2）重組體DNA分子的構(gòu)建（3）基因擴(kuò)增（4）重組體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（5）檢測(cè)和培養(yǎng)（6）轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模種植13.2.2基因工程在園藝植物遺傳育種中的應(yīng)用1）創(chuàng)造園藝植物新種質(zhì)2）改良品質(zhì)3）提高抗病蟲害的能力4）改善抗逆性5）選育抗除草劑品種6）延緩果實(shí)成熟7）培育雄性不育系8）改變花卉的花色、花形和花香9）植物生物反應(yīng)器10）改良其它性狀13.2.3轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性及對(duì)策1）轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性（1）轉(zhuǎn)基因植物演變?yōu)檗r(nóng)田雜草的可能性（2）基因漂流到近緣野生種的可能性（3）轉(zhuǎn)基因植物對(duì)生物種群的影響2）轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性（1）有毒物質(zhì)（2）過敏源3）轉(zhuǎn)基因植物生物安全性問題的對(duì)策①繼續(xù)完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)②加強(qiáng)對(duì)基因工程生物及其產(chǎn)品的安全性和可能產(chǎn)生的危害進(jìn)行研究③建立完善的檢測(cè)體系和質(zhì)量審批制度④有關(guān)決策層應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)化速度進(jìn)行有序調(diào)控⑤通過多渠道、多層次的科普宣傳，培養(yǎng)公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其安全性問題的客觀公正意識(shí)，從而培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有一定了解、認(rèn)識(shí)和判斷能力的消費(fèi)群體，并規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場(chǎng)。13.3分子標(biāo)記輔助育種13.3.1分子標(biāo)記的概述所謂分子標(biāo)記有廣義和狹義之分，廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)；而狹義分子標(biāo)記則是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標(biāo)記的特點(diǎn)如下：①直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育時(shí)期均能檢測(cè)到，不受環(huán)境影響，不存在表達(dá)與否的問題；②數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組；③多態(tài)性高，自然存在許多等位變異，不需要專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；④不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然連鎖；⑤許多分子標(biāo)記能夠鑒別純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息。1）分子標(biāo)記的分類第一類為基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記，主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記和可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）標(biāo)記。第二類是基于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的DNA標(biāo)記。第三類為基于PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的DNA標(biāo)記，為兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）標(biāo)記等。第四類為基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記，即SNP標(biāo)記。2）常用分子標(biāo)記的基本原理及技術(shù)（1）RFLP標(biāo)記（2）RAPD標(biāo)記（3）SSR標(biāo)記（4）ISSR標(biāo)記（5）SCAR標(biāo)記（6）SRAP標(biāo)記（7）AFLP標(biāo)記（8）SNP標(biāo)記13.3.2分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的處理與分析1）數(shù)據(jù)的獲得2）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（1）共有帶與特征帶（2）相似性系數(shù)與距離矩陣3）表征分析與系統(tǒng)發(fā)育分析（1）樹狀圖（2）NTSYS-pc簡(jiǎn)介13.3.3分子標(biāo)記在園藝植物遺傳育種中的運(yùn)用1）品種鑒別與分類2）遺傳多樣性檢測(cè)3）親緣關(guān)系及系譜分析4）分子遺傳圖譜的構(gòu)建5）基因定位6）早期預(yù)選與聚合育種7）特殊種質(zhì)的鑒定育種方法原理變異的原因操作（常用方法）評(píng)價(jià)引種引入新基因型引入群體引進(jìn)新品種見效快，但有適應(yīng)性局限選擇育種基因突變改變基因頻率和基因型頻率個(gè)體選擇地方品種選擇或提純雜交育種（含遠(yuǎn)緣雜交）基因重組非同源染色體上的非等位基因的自由組合植物之間雜交耗時(shí)長(zhǎng)，但可預(yù)見性強(qiáng)優(yōu)勢(shì)育種基因互作等位和非等位基因間的互作植物之間雜交親本純化耗時(shí)長(zhǎng)，但可預(yù)見性強(qiáng)誘變育種