染色體免疫共沉淀

關(guān)于染色體免疫共沉淀第1頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三前言基因表達(dá)是一個(gè)十分復(fù)雜而有序的過(guò)程，它是眾多的反式因子和順式作用元件之間相互作用的結(jié)果。

與原核生物不同，真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。

因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。第2頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三常用的研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的方法1.凝膠電泳遷移率改變分析

（EMSA）2.DNaseⅠ足跡法（footprinting）3.染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)第3頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三凝膠電泳遷移率改變分析（EMSA）在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽(yáng)極移動(dòng)的速度快，因此，可標(biāo)記短的雙鏈DNA片段，將其與蛋白質(zhì)混合，對(duì)混合物進(jìn)行凝膠電泳，若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，其向陽(yáng)極移動(dòng)的速度受到阻滯，對(duì)凝膠進(jìn)行放射性自顯影，就可找到DNA結(jié)合蛋白。由于其特異性好，DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)常用來(lái)鑒定其他方法篩選出的結(jié)果第4頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNaseⅠ足跡法（footprinting）蛋白結(jié)合在DNA片段上，保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒(méi)有放射性標(biāo)記條帶。第5頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三凝膠電泳遷移率改變分析

（EMSA）與DNaseⅠ足跡法均為研究體外DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法，但不能直接對(duì)體內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行研究。而CHIP是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。第6頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三同時(shí)，由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點(diǎn)，膠電泳遷移率改變分析（EMSA）獲取的結(jié)果不一定能真實(shí)地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。

第7頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來(lái)的方法，它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。第8頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三CHIP原理

在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。第9頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三第10頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三操作步驟

其操作步驟可大致分為固定、沉淀和檢測(cè)三步第一步：固定，即在活細(xì)胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段。第11頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。第12頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三步：目的片段的純化與檢測(cè)，即經(jīng)蛋白質(zhì)與DNA解偶聯(lián)，DNA片段純化等處理后，用PCR等方法檢測(cè)DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.第13頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三條件選擇1、超聲波破碎條件的選擇2、抗體量的選擇3、PCR反應(yīng)條件的選擇第14頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三應(yīng)用1、組蛋白修飾酶的抗體作為“生物標(biāo)記”

2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

3、藥物開發(fā)研究

4、有絲分裂研究

5、DNA損失與凋亡分析第15頁(yè)，講稿共17頁(yè)，2023年5月2日，星期三擴(kuò)展應(yīng)用

CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍:1、CHIP與基因芯片相結(jié)合所建立的CHIP-on-CHIP方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；2、

CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位