臨床生化檢驗方法學評價試驗課件

貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系

黃海實驗27

臨床生化檢驗方法學評價試驗

.1實驗目的掌握：方法學評價試驗的原理和基本方法及統(tǒng)計分析

熟悉：方法學評價試驗的具體操作。.2一、重復性實驗二、回收試驗三、干擾試驗四、方法比較試驗五、方法性能決定圖繪制六、最低檢測限實驗.3實驗原理批內(nèi)重復性試驗是指在同一條件下（用同樣的方法，同一種試劑和標準品，同一臺儀器，在同一實驗室由同一人操作，并保持實驗期間準確度不變）對同一標本在盡可能短的時間內(nèi)進行m輪，每輪n次重復測定，以獲得批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)的試驗方法。其結果能反映測定方法的隨機誤差大小。一、重復性實驗.4試劑與器材1.標本采用血糖濃度約為6.7mmol/L的血清標本（收集無溶血、無脂濁、無肝炎病毒污染的人混合血清或動物血清）。2.GOD-POD試劑盒。.5操作步驟將血清標本用GOD-POD法作5輪，每輪4次血糖測定，即可獲得20個測定數(shù)據(jù)。.6計算1.檢驗20次測定數(shù)據(jù)中的離群值如存在異常值時應剔除。對小樣本測定來講，可采用Grubbs檢驗，該方法是最合理的檢驗方法。.7計算用Grubbs檢驗準則，檢驗離群值的統(tǒng)計學公式是：式中，Xd為離群值；X為包括離群值在內(nèi)的測定值的均數(shù)；s為包括離群值在內(nèi)的測定值的標準差.8如計算的G值大于系數(shù)表中相應顯著水平的a和測定次數(shù)n時的臨界值Ga.n，則將Xd作為異常值舍棄，可按下列三種情況來處理：（1）只有一個離群值的情況：設有n個測定數(shù)（X1<X2<X3<X4<……<Xn）其中X1為離群值，即可利用上述公式，直接對X1進行檢驗。計算.9（2）如果離群值是兩個或兩個以上，但都分布在均數(shù)X的同一側，例如X1、X2都是離群值，則首先檢驗最內(nèi)側的一個數(shù)據(jù)（X2），即通過檢驗G2來決定X2是否應該放棄。如果X2應該放棄，X1自然也應該放棄。如果X2不應舍去，則再檢驗X1。但在檢驗X1時測定次數(shù)不應作為少了一次。計算.10（3）如果離群值有兩個或兩個以上。而且又分布于均數(shù)兩側，例如X1和Xn都屬于離群值，則分別檢驗X1和Xn，是否應該舍去。如果一個數(shù)據(jù)決定舍去，那么再檢驗另一個數(shù)據(jù)時，測定次數(shù)應該作為減少一次來處理；而且此時應該選擇99%的置信水平。計算.112.按照批內(nèi)精密度的計算公式計算5輪每輪4次測定值的平均數(shù)(X)、標準差(s)和變異系數(shù)（CV%）。（1）（2）式中為5輪各次測定值的方差，即：公式.12首先計算出每輪測定值的均數(shù)、標準差（Si）及方差S1、S2、S3、S4，并將數(shù)值填入表27-1內(nèi)，再將5輪Si總和代入公式即可算出批內(nèi)標準差Sw。最后計算出變異系數(shù)（CV%）表27-1批內(nèi)重復性試驗的數(shù)據(jù)處理測定批數(shù)每輪測定次數(shù)（n）及測定值（Xi）∑XiSiSi2123412345合計.13注意事項血糖的醫(yī)學決定水平值為2.8mmol/L、6.7

mmol/L和8.9mmol/L。分析物濃度應選擇醫(yī)學決定水平才更具價值。2.用于評價方法精密度的變異系數(shù)應該是剔除離群值后的計算結果。.14評價批內(nèi)不精密度的判斷限是1/4允許誤差范圍。批間不精密度的判斷限是1/3允許誤差范圍。允許誤差范圍可以根據(jù)CLIA88規(guī)定的能力比對試驗的TEa確定。返回本實驗目錄.15實驗原理二、回收試驗回收試驗是用以發(fā)現(xiàn)分析方法比例系統(tǒng)誤差的有效評價方法。即通過測定GOD-POD法測定血糖的回收率，能較確切地判斷該分析方法比例系統(tǒng)誤差的有無或大小，從而評價方法的準確性。.16試劑與器材80mmol/L葡萄糖標準液生理鹽水3.GOD-POD試劑盒4.血清標本收集無肝炎病毒、無溶血、無脂濁的人混合血清，先用GOD-POD法測定血糖濃度，再用生理鹽水稀釋血糖濃度至2.2mmol/L備用。.17操作步驟1.樣品制備基礎樣品：血清0.9ml+0.1ml生理鹽水?；厥諛悠发瘢貉?.9ml+0.01ml80mmol/L葡萄糖標準液+0.09ml生理鹽水。回收樣品Ⅱ：血清0.9ml+0.06ml80mmol/L葡萄糖標準液+0.04ml生理鹽水。回收樣品Ⅲ：血清0.9ml+0.09ml80mmol/L葡萄糖標準液+0.01ml生理鹽水。2.血糖濃度測定按GOD-POD法測定各制備樣品的血糖濃度，每份樣品作雙份檢測，結果取平均值.18計算1.加入濃度計算2.回收量計算2.回收率計算將各項計算結果填入表27-2。.19表27-2回收試驗的數(shù)據(jù)處理樣品測定濃度（mmol/L）加入濃度（mmol/L）回收濃度（mmol/L）回收率（%）基礎樣品回收樣品Ⅰ回收樣品Ⅱ回收樣品Ⅲ平均回收率.20注意事項1.標本加入標準液后，總濃度應在該方法的分析范圍內(nèi)。最好使被測標本的濃度達到醫(yī)學決定水平，血糖測定的醫(yī)學決定水平為2.8mmol/L、6.7mmol/L、8.9mmol/L。2.純標準品溶液的加入體積不得超過血清樣品的10%，若稀釋過大，誤差將發(fā)生改變。3.準確加量是本試驗最主要的技術關鍵。.21評價一般檢驗方法，要求回收率在95~105%之間，最理想的回收率應為100%

返回本實驗目錄.22三、干擾試驗實驗原理

干擾試驗是測定特異性和干擾兩者引起的誤差。干擾物濃度一定時，產(chǎn)生的誤差是恒定系統(tǒng)誤差，誤差的實際大小隨干擾物的濃度而異。.23三、干擾試驗實驗原理選用尿酸作GOD-POD法測定血糖的干擾試驗，尿酸可疑和GOD反應生成的H2O2發(fā)生反應，使部分H2O2不能參與第二步POD的耦聯(lián)反應，從而降低顯色強度，產(chǎn)生負的測定誤差。尿酸對該反應有干擾，但不是尿酸被測定。干擾試驗既用于檢測某方法的特異性，也用于檢測干擾物質(zhì)對方法的干擾作用，以評價分析方法的準確性。.24試劑與器材1.血清標本收集血糖濃度為6.7mmol/L的混合血清（要求同回收試驗）。2.9.0mmol/L尿酸標準液。3.GOD-POD試劑盒。.25操作步驟1.樣品制備基礎樣品：血清0.9ml+蒸餾水0.1ml干擾樣品Ⅰ：血清0.9ml+9.0mmol/L尿酸標準液0.05ml+蒸餾水0.05ml干擾樣品Ⅱ：血清0.9ml+9.0mmol/L尿酸標準液0.1ml尿酸樣品：蒸餾水0.9ml+9.0mmol/L尿酸標準液0.1ml2.GOD-POD法測定各樣品血糖。.26計算1.干擾物加入值計算

2.干擾值計算3.干擾率計算.27將各項計算結果填入表27-3內(nèi)表27-3干擾試驗的數(shù)據(jù)處理樣品葡萄糖測定值（mmol/L）加入尿酸值（mmol/L）干擾值（mmol/L）干擾率（%）基礎樣品干擾樣品Ⅰ干擾樣品Ⅱ尿酸樣品.28注意事項1.可疑干擾物濃度加入可疑干擾物的濃度應明顯高于通常所見濃度的上限，最好達到病理標本的最高值，尿酸升高的變動范圍在0.42mmol/L~0.9mmol/L之間。2.干擾物對測定的影響與被分析物濃度無關，而與干擾物本身的濃度有關，所以產(chǎn)生的誤差是恒定系統(tǒng)誤差。3.其他注意事項與回收試驗相同。.29評價偏差Bias<允許誤差（EA）的臨界值，表明由于干擾物引起的偏差對臨床診斷和治療不產(chǎn)生不良影響，是可以被接受的。血2.8mmol/、6.7mmol/和8.9mmol/L時的EA為0.56mmol/L。返回本實驗目錄.30四、方法比較試驗實驗原理用兩種方法同時檢測一批樣本，計算出兩種方法間測定結果的差異，用以估計試驗方法在檢測樣本時可能引入的誤差。當選擇準確度已知的常規(guī)方法作為比較方法時，部分誤差來自比較方法，其他部分誤差則來自試驗方法。若選擇準確度高的參考方法作為比較方法，可把方法間的任何分析誤差都歸于試驗方法。本實驗以HK法測定血糖的參考方法作對比來評價GOD-POD法測定血糖的總系統(tǒng)誤差。.31試劑與器材1.GOD-POD法試劑盒2.HK法試劑試劑盒3.血清標本40份（其濃度盡可能覆蓋線性范圍）。

.32操作步驟1.取40份血清標本，每份標本用GOD-POD和HK兩種方法，分別作雙份測定。2.每次（天）測定8個標本，雙份測定時第一次按順序1，2…….7，8，第二8，7…….2，1，共測試5次（天）。并計算兩法各自的測定結果。.33計算1.將實驗結果作散點圖，圖中以x軸代表比較方法的測定值，y軸代表實驗方法的測定值，在坐標紙上作圖應散布于整個測定范圍之內(nèi)。通過散點圖可以觀察到，測定數(shù)據(jù)的分布趨勢，若所有測定值在坐標圖中大致呈45°角的直線分布，提示被實驗方法與比較方法的測定結果之間存在密切的相關關系；若呈明顯的曲線分布，雖然在統(tǒng)計學上可按照非線性資料處理，但在這種情況下，實驗方法被采用的可能性極小。.34計算2.如果x、y之間呈直線關系，可作直線回歸的統(tǒng)計處理，計算：回歸方程y=a+bx和相關系數(shù)r。其結果可以顯示實驗方法的測定結果有無系統(tǒng)誤差存在。截距a反映恒定系統(tǒng)誤差的大??；斜率b反映比例系統(tǒng)誤差的大??；相關系數(shù)r反映兩種方法相關性的密切程度。.35在評價一個實驗方法時，最理想的情況是回歸直線呈45°角通過零點，這時a=0，b（x/y比值）=1.0，表明恒定系統(tǒng)誤差和比例系統(tǒng)誤差均不存在。但x和y都會有隨機誤差，a和b只是估計值，會有所波動，只要偏離程度比較小，該方法就能用于臨床檢驗的常規(guī)分析。計算.363.根據(jù)計算出的回歸方程的a、b值，可以計算候選方法系統(tǒng)誤差（SE）的大小，并與不同醫(yī)學決定水平（Xc）的允許誤差（EA）作比較，對被評價方法的系統(tǒng)誤差的可接受性作出判斷。SE的可接受性判斷指標為血糖測定的Xc=2.8mmol/L、6.7mmol/L、8.9mmol/L時，Barnett提出的EA值為0.56mmol/L。計算.37作相關分析在方法比較試驗中，相關系數(shù)（r）可作為被評價方法可否被接受的一項統(tǒng)計學指標。對相關系數(shù)還應作相關系數(shù)的t檢驗。相關系數(shù)（r）的t檢驗統(tǒng)計學公式是：計算.385.方法比較試驗的數(shù)據(jù)屬于配對資料，因而可作配對t檢驗，其統(tǒng)計學公式是：式中:

d代表候選方法與參考方法測定值的差值(或正或負)；d為差值之平均值；n為配對數(shù)。計算.39在計算t值公式中的分子部分是兩種方法的偏差值，表明方法間系統(tǒng)誤差的大小。分母是平均偏差標準誤，反映方法比較實驗中隨機誤差的大小。因此t值時方法比較試驗中系統(tǒng)誤差和隨機誤差的比值。計算.40注意事項1.選擇試驗樣品一般作40~100例，包括常規(guī)工作中可能遇到的整個分析范圍（其中25%的標本低于參考范圍下限，50%標本在參考范圍之內(nèi)，25%標本高于參考范圍），選擇合適的樣品分析范圍比增加樣品的數(shù)目更為重要。.41注意事項2.試驗方法一般每個樣品用兩種方法各測一次，最好每個樣品用兩種方法各測定兩次，在做雙份第二次測定時，標本順序應全部倒過來，最好在4h內(nèi)完成。3.對比方法對比方法的選擇十分重要，一般應選參考方法或決定性方法，這樣方法間的任何分析誤差都可歸于被評價的候選方法。返回本實驗目錄.42五、方法性能決定圖繪制實驗原理準確度和精密度是檢測系統(tǒng)的兩大最主要的性能指標，二者結合就是總誤差（totalerror，TE）。當TE小于允許總誤差（allowabletotalerror，TEa）時，則檢測系統(tǒng)的性能合格。當TE大于TEa時，則檢測系統(tǒng)的性能不可接受。.43五、方法性能決定圖繪制實驗原理目前，有三種計算誤差TE的方式（bias代表不準確度，s或CV代表不精密度）：（1）TE=bias+2s<TEa；或：TE%=bias%+2CV%<TEa%（2）TE=bias+3s<TEa；或：TE%=bias%+3CV%<TEa%（3）TE=bias+4s<TEa；或：TE%=bias%+4CV%<TEa%.44應用Westgard方法決定圖（methoddecisionchart,MDC），將不準確度和不精密度以圖像的形式表達，在圖上與要求的質(zhì)量作比較，結果簡單明了。根據(jù)以上幾次的實驗結果，應用MDC，可以對葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)的性能作一綜合性的評價。五、方法性能決定圖繪制實驗原理.45操作步驟1.實驗數(shù)據(jù)采用前面實驗的結果。重復性試驗中得到的CV作為橫坐標，然后利用方法比對實驗中得到的回歸方程y=a+bx，以重復性實驗中標本均值為Y值，求出對應的X值，計算：.46操作步驟2.取坐標紙，按圖27-1所示作圖。首先確定分析質(zhì)量要求，以總允許誤差TEa表示。本實驗血糖的TEa是10%，在坐標紙上定義y軸為允許不準確度（偏倚%），從0到Tea，最大刻度10%；定義x軸為允許不精密度（%，即CV），從0到0.5TEa，即最大刻度為5%。.47從y軸的TEa（10）到x軸的0.5TEa（5.0）即過（0，10.0；5.0，0）兩點畫一直線，為偏倚+2s線。從y軸的TEa（10）到x軸的0.33TEa（3.3）即過（0，10.0；3.3，0）兩點畫一條線，為偏倚+3s線。從y軸的TEa（10）到x軸的0.25TEa（2.5）即過（0，10.0；2.5，0）兩點畫一直條線，為偏倚+4s線。這三條分別把圖劃分成四個部分。從上到下，分別代表性能差區(qū)、臨界性能區(qū)、性能良好區(qū)和性能優(yōu)秀區(qū)。.483.方法性能判定的不同水平結果觀察方法決定圖上操作點的位置，判斷方法性能。四種可能分別為：①性能差，表明該測定方法不能滿足質(zhì)量要求，對于常規(guī)操作不能被接受。操作步驟.49②臨界性能，表明該性能盡管能滿足臨床要求，但很可能失控，日常操作中，需要全面質(zhì)量控制策略，增加訓練有素的操作者，減少人員的輪轉，增強儀器維護措施，小心監(jiān)測病人檢測結果，持續(xù)努力地改善方法性能。操作步驟.50③良好，表明該測定方法能滿足質(zhì)量要求，在日常工作中，只要小心計劃統(tǒng)計質(zhì)量程序且能運用每批4~6個控制測定值的多規(guī)則質(zhì)控方案，測定方法就能被很好地進行管理。④優(yōu)秀，在日常工作中測定方法易于管理，只需最少的花費，通常每批2個控制測定個數(shù)，單規(guī)則的質(zhì)控方案就能很好的控制。操作步驟.51臨界性能性能差性能優(yōu)秀性能良好圖27-1允許總誤差示意圖返回本實驗目錄.52六、最低檢測限實驗實驗原理選擇合適的空白標本，該標本與待測標本的區(qū)別在于不含有待測物質(zhì)。事實上，除了藥物測定外（因藥物不存在正常體液中），其他空白標本只能近似于要求的條件。一般用處理過的標本，如破壞或移除標本中的待測物，或用一般標本只是在分析步驟中省去關鍵的試劑或操作。本試驗采用后者，在GOD-POD法測血糖試劑中省去的GOD試劑，其他試劑不變，經(jīng)多次測定，求出吸光度的均數(shù)和標準差，計算檢出限。.53試劑與器材在GOD-POD法測定血糖的酶混合液試劑中除去GOD，其他試劑的組成成分及濃度不變。.54操作步驟