艾滋病檢測方法及規(guī)范操作

HIV實驗室檢測及標準操作中華醫(yī)學(xué)會檢驗中心艾滋病檢測的方法HIV抗體檢測HIV抗體初篩檢測HIV抗體確認檢測〔免疫印跡試驗〕HIV核酸檢測?核酸序列依賴性擴增〔NASBA〕?HIV定量逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)〔RT－PCR〕?HIVRNA定量檢測的分支測定法〔bDNA)艾滋病檢測方法的意義HIV抗體檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗?間接法?直接法〔雙抗原夾心法〕?抗體競爭法明膠顆粒凝集試驗〔PA〕快速法HIV/AIDS的篩查，但初篩陽性結(jié)果不能做為艾滋病診斷依據(jù)，需將該標本送地區(qū)篩查中心實驗室用兩種方法進行復(fù)核，仍為陽性或一陰一陽那么須送省確認中心。

艾滋病檢測方法的意義HIV抗體確認檢測〔免疫印跡試驗〕HIV/AIDS診斷的唯一依據(jù),省CDC確認實驗室負責(zé)全省監(jiān)測哨點以及常規(guī)檢測中陽性及可疑標本確實認和省內(nèi)HIV初篩實驗室的質(zhì)量管理.另外,省檢疫系統(tǒng)有一個確認實驗室,設(shè)在省檢疫局保健中心.艾滋病檢測方法的意義HIV核酸檢測?輔助診斷：在特殊情況下，如出現(xiàn)某些非典型的抗體反響，特別是不確定反響時，RNA的測定可提供有用的證據(jù)。?感染早期：在HIV感染的窗口期，無法使用抗體檢測進行診斷，此時RNA的測定具有特殊的意義，提示是否有感染的可能，但仍需追蹤檢測HIV抗體，最終根據(jù)抗體的檢測情況做出診斷。?病程監(jiān)控：幫助確定疾病開展的階段。?指導(dǎo)治療方案及療效測定?預(yù)測疾病進程國家對HIV抗體檢測試劑的要求◆初篩試劑

篩查試劑必須是HIV1+2混合型的、經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、批批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑?！舸_認試劑

必須經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準。我國常用的HIV抗體檢測試劑?HIV抗體篩查試劑?酶聯(lián)免疫：初篩實驗室的常用根本試劑。?明膠顆粒凝集?其它快速診斷試劑：在尚未建立艾滋病篩查實驗室的偏遠地區(qū)由經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場所使用。?HIV抗體確認試劑?免疫印跡試劑快速檢測試劑的優(yōu)缺點硒標記法和金標記法與ELISA相比?優(yōu)點所需時間短操作簡便，不需特殊設(shè)備。試劑貯存于室溫。?缺點特異性和敏感性與ELISA有差距。費用較高。HIV抗體檢測程序及流程圖1、篩查試驗標本驗收合格后，用篩查試劑進行檢測，如呈陰性反響，報告為HIV抗體陰性；對呈陽性反響的標本須進行重復(fù)檢測。2、重復(fù)檢測用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑重復(fù)檢測，如兩種試劑復(fù)測均呈陰性反響，那么報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反響，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。3、篩查試驗的流程圖樣品篩查檢測篩查試劑陽性反響重復(fù)檢測均陽性反響一陰一陽送確認實驗室進行確認均陰性反響陰性報告陰性反響原有試劑加另一種篩查試劑HIV抗體篩查結(jié)果的報告和處理?篩查試驗呈陰性反響，出具HIV抗體陰性報告〔提示應(yīng)考慮窗口期的可能〕。?篩查試驗呈陽性反響，可出具“HIV待復(fù)查〞報告，不能出陽性報告。同時盡快進行以下處理：?填寫HIV陽性標本送檢單，并隨標本送至當(dāng)?shù)睾Y查中心實驗室，或直接送確認實驗室。?篩查中心實驗室應(yīng)盡快用兩種試劑進行復(fù)測，如結(jié)果均陽性或一陰一陽，那么應(yīng)將該標本和送檢單一并送至省艾滋病確認實驗室確認。?陽性標本必須送省確認中心，篩查實驗室不能隨意處理。?做好檢測后的咨詢結(jié)果的解釋問題:HIV抗體檢測結(jié)果陰性是否說明未感染?對不確定結(jié)果如何解釋?怎么樣知道嬰兒是否感染了HIV?HIV抗體初篩檢測結(jié)果解釋陰性(1)未感染HIV(2)可能感染了HIV,但處于窗口期,或HIV-1/2抗體和HIV-1O亞型抗體低于檢測下限。(3)疾病晚期,免疫功能缺損,抗體可能呈陰性.確認陽性感染了HIV,樣品含有HIV-1/2抗體和HIV-1O亞型抗體(未滿18個月的嬰兒除外).不確定:建議追蹤檢測.HIV抗體初篩檢測結(jié)果解釋什么是不確定結(jié)果？HIV抗體確認試驗時,試驗條帶上出現(xiàn)的蛋白帶型缺乏以判斷為HIV抗體陽性,應(yīng)建議其3個月后復(fù)查.?如果復(fù)查結(jié)果陽轉(zhuǎn),說明受檢者已感染HIV;?如復(fù)查時條帶全部消失,那么為陰性結(jié)果;?如復(fù)查時條帶沒有變化或有變化但仍缺乏以判斷為陽性,那么應(yīng)建議其3個月后再復(fù)查一次,如還不能判斷為陽性結(jié)果,那么應(yīng)作為陰性對待.HIV抗體初篩檢測結(jié)果解釋造成檢測結(jié)果不確定的原因(1)處于窗口期,血清中還沒有形成典型的HIV抗體。(2)艾滋病進展到終末期,人體免疫力缺陷,抗體水平下降。(3)與其他非病毒蛋白抗體有交叉反響.自身免疫性疾病、惡性腫瘤、懷孕、輸血或器官移殖等，此時，身體產(chǎn)生的一些抗體與Ｐ２４核心蛋白抗體相似。(4)以前接種過HIV疫苗。HIV抗體初篩檢測結(jié)果解釋如何判斷嬰兒是否感染了HIV？通過胎盤，感染了HIV的母親所生的嬰兒可能帶有來自母體的HIV抗體，此時HIV抗體檢測陽性并不意味著已被感染。?建議在嬰兒9個月時進行HIV初篩檢測如陰性，那么判定為未感染HIV。如陽性，那么應(yīng)在嬰兒18個月時進行復(fù)檢陰性：判定為未感染。陽性：那么將血樣送至省CDC確認中心進行HIV抗體確實認試驗。HIV抗體初篩檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗〔enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA〕ELISA法中有間接法、夾心法和競爭法。目前使用最多的是夾心法。

HIV抗體初篩檢測〔ELISA實驗原理〕酶球〔酶標記抗原〕抗體HIV抗體初篩檢測

ELISA夾心法

原理將HIV抗原包被到固相載體上，標本中的HIV抗體與包被的HIV抗原結(jié)合形成復(fù)合物，利用抗體的多價性，又與酶〔HRP〕標記的同類HIV抗原也即酶標板內(nèi)的球狀復(fù)合物，形成一個HIV抗原抗體酶標記的HIV抗原復(fù)合物，最后參加底物，避光30分鐘，在酶作用下，產(chǎn)生顯色反響，加2N硫酸終止后呈黃色，在450/620nm雙波長下測定光密度值，與標準進行比較，以判定標本的結(jié)果。HIV抗體初篩檢測

材料標本，試劑盒，酶標儀和洗板機，其它試驗根本材料。方法以荷蘭阿克蘇試劑盒為例⑴實驗前試劑應(yīng)在室溫下放置30分鐘，使用后試劑放回2~8℃⑵配制洗液1×25洗液用蒸餾水1：25稀釋。稀釋后可在2~8℃穩(wěn)定2周。⑶TMB與尿過氧化物溶液等量混合準備成TMB底物。因其穩(wěn)定性有限，所以應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。配制后的TMB底物為無色，在避光下可以穩(wěn)定6個小時。HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕⑷每孔參加100ul血清稀釋液，注意不準碰到孔內(nèi)的酶球。⑸在所確定的孔中參加50ul血清標本或?qū)φ?；設(shè)3孔陰性、1孔HIV-1陽性、1孔HIV-2陽性對照。⑹混勻，蓋上貼膜放入37℃環(huán)境孵育1小時。孵育結(jié)束前5分鐘，準備充足的TMB底物液。⑺撕去貼膜，用新配制洗滌液洗板〔洗板次數(shù)根據(jù)試劑盒要求〕。吸干，每孔參加100ulTMB底物液。⑻置室溫〔18~25℃〕閉光孵育30分鐘。⑼每孔參加100ul2N硫酸終止反響。⑽在450nm〔單波長〕或450/620nm〔雙波長〕讀取光密度值〔OD值〕〔應(yīng)在終止反響2小時內(nèi)進行讀數(shù)〕。HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕結(jié)果判定⑴陰性對照〔NegativeControl,，NC〕的參考標準NC必須＜0.250，去除≥0.250的各孔；計算剩余NC的平均值〔NCx〕0.6NCx＜NC＜1.4NCX,如果有一個以上超出此范圍，去除后重新計算NCx。⑵判定實驗有效性：至少有2個陰性對照OD值有效。PC1-NCx≥0.400〔PC1：HIV-1抗體陽性對照值〕PC2-NCx≥0.400〔PC2：HIV-2抗體陽性對照值〕HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕⑶臨界值〔Cutoff〕如果實驗有效，按照公式計算界限值：Cutoff=NCx+0.100⑷實驗結(jié)果判定如果OD值≥Cutoff值，那么樣品為陽性；如果OD值＜Cutoff值，那么樣品為陰性。HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕＊計算舉例NC=0.089；0.093；0.091PC1=1.155PC2=1.069NCx=0.091去除異常的質(zhì)控對照去除NC≥0.250，無去除去除NC＞1.4NCx1.4×0.091=0.127無去除去除NC＜0.6NCx0.6×0.091=0.055無去除確定以下條件滿足PC1-NCx≥0.4001.155-0.091=1.064通過PC2-NCx≥0.4001.069-0.091=0.987通過計算臨界值Cutoff=NCx+0.100=0.091+0.100=0.191HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕本卷須知⑴超過有效期的試劑不能使用，樣品和試劑應(yīng)處于室溫，使用后試劑放回2-8℃。⑵為了防止污染，不要用手指或加樣器尖接觸酶標板孔及孔內(nèi)的酶復(fù)合物。⑶所有的加樣步驟要精心準確，試劑或樣品的交叉污染會引起錯誤的結(jié)果，防止微生物或其它污染物污染。⑷去除酶標板孔內(nèi)的氣泡，如果需要，輕輕拍打板架。⑸洗板機要經(jīng)常保養(yǎng)，防止交叉污染。HIV抗體初篩檢測〔阿克蘇ELISA〕⑹非重復(fù)有活性反響結(jié)果〔假陽性〕可能屬于以下一個或多個技術(shù)問題引起：①由于儀器或加樣器尖造成的交叉污染。②底物被金屬離子污染。③由于潮濕或試劑滴漏造成的交叉污染。④不充分的洗板或最后吸去不徹底。⑤讀數(shù)錯誤，在酶標板底部有水滴或在酶標板孔內(nèi)有氣泡。HIV抗體檢測明膠顆粒凝集試驗〔gelatinparticleagglutination,PA)以日本富士藥廠和珠海麗珠試劑廠生產(chǎn)的試劑盒為例原理經(jīng)HIV抗原致敏的明膠顆粒與血清中的抗體發(fā)生特異性抗原-抗體結(jié)合并產(chǎn)生肉眼可見的凝集反響。優(yōu)點操作簡便，快速，無需特殊儀器設(shè)備，適合門診少量標本的檢測。HIV抗體檢測〔明膠顆粒凝集試驗〕材料血清標本,U型板,PA試劑盒(“A〞溶解用液,〞B〞血清稀釋液,〞C〞致敏顆粒,〞D〞非致敏顆粒,陽性對照血清,專用滴管.方法(1)從4℃冰箱取出試劑盒,恢復(fù)至室溫后使用.(2)從1:4開始做倍比稀釋.(3)用專用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏顆粒〞D〞,第三孔加1滴(25ul)致敏顆粒〞C〞.(4)輕輕拍打微量板或在振蕩器上振蕩1分鐘混合后,室溫(20℃)靜置2小時后觀察結(jié)果.HIV抗體檢測〔明膠顆粒凝集試驗〕結(jié)果判斷明膠顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈者為陰性結(jié)果.(-)明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán),周邊平滑為可疑反響.(+_)孔內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙者,為陽性結(jié)果.(+/++)孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整個孔底者為強陽性反響.(+++/++++)孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,那么需作重吸收試驗后進一步檢測.確認試驗的試劑

必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、在有效期內(nèi)的試劑。

確認試驗方法

包括免疫印跡試驗〔WB〕、條帶免疫試驗〔LIATEKHIVⅢ〕、放射免疫沉淀試驗〔RIPA〕及免疫熒光試驗〔IFA〕。國內(nèi)常用確實認試驗方法是WB。HIV抗體確認試驗確認檢測流程

有HIV-1/2混合型和單一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-1/2混合型試劑進行檢測，如果呈陰性反響，那么報告HIV抗體陰性；如果呈陽性反響，那么報告HIV-1抗體陽性；如果不滿足陽性標準，那么判為HIV抗體檢測結(jié)果不確定。如果出現(xiàn)HIV-2型的特異性指示條帶，需用HIV-2型免疫印跡試劑再做HIV-2的抗體確認試驗，呈陰性反響，報告HIV-2抗體陰性；呈陽性反響那么報告HIV-2抗體血清學(xué)陽性,并將樣品送國家參比實驗室進行核酸序列分析。HIV抗體確認檢測流程免疫印跡法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1陽性反應(yīng)不確定反應(yīng)出現(xiàn)HIV-2指示條帶報告HIV-1陽性不確定反應(yīng)陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)報告陰性每3個月隨訪1次，共2次，仍屬可疑，則報告陰性；如隨訪期間HIV抗體出現(xiàn)陽性反應(yīng)則報告陽性。隨訪期間可根據(jù)需要，檢測病毒核酸和或P24抗原，作為輔助診斷。陰性反應(yīng)報告陰性篩查試驗陽性反應(yīng)樣品報告HIV-2血清學(xué)陽性免疫印跡法（WB\HIV-2）艾滋病實驗室診斷確認試驗

(蛋白印跡Western-Blot)試驗原理病毒裂解物抗原經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)別離,然后將別離后的抗原轉(zhuǎn)移(印跡)到硝酸纖維薄膜上,采用類似ELISA的技術(shù),當(dāng)樣品中含有HIV抗體時,它和印跡在硝酸纖維薄膜上的病毒抗原相結(jié)合呈現(xiàn)肉眼可見的特異性帶型.HIV-1型主要基因有:核蛋白帶gag(p17/18,p24,p55),酶蛋白帶pol(p31,p51,p66),外膜蛋白帶env(gp41,gp120,gp160)確認試驗結(jié)果的判定

下面是我國使用WB確認HIV感染的判定標準和判定結(jié)果的根本原那么。在實際工作中還應(yīng)參照所用試劑盒說明書綜合判定，遇疑難情況應(yīng)報上級實驗室解決。

&HIV-1抗體陽性〔+〕

至少有2條env帶〔gp41和gp160/gp120〕出現(xiàn)，或至少1條env帶和p24帶同時出現(xiàn)。

&HIV-2抗體血清學(xué)陽性〔+〕

同時符合以下2條標準可判為HIV-2抗體血清學(xué)陽性：

〔1〕符合WHO陽性判定標準，即出現(xiàn)至少2條env帶〔gp36和gp140/gp105〕。

〔2〕符合試劑盒提供的陽性判定標準。

&HIV抗體陰性〔-〕

無HIV抗體特異帶出現(xiàn)。

&HIV抗體不確定〔±〕

出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但缺乏以判定陽性。

?HIV-1抗體特異帶包括：

env帶gp160/gp120、gp41；

gag帶p55、p24、p17〔或p18〕；pol帶p66〔或p65〕、p51、p31。

?HIV-2抗體特異條帶包括：

env帶gp140/gp105、gp36；

gag帶p56、p26、p16；

pol帶p68、p53、p34。

〔由于使用的毒株不同，HIV-2env帶也可為gp125/gp80、gp36〕。HIV抗體確認試驗結(jié)果報告

確認試驗由確認實驗室根據(jù)檢測結(jié)果出具“HIV抗體確認檢測報告單〞〔附表3〕，報告HIV抗體陽性〔+〕、HIV抗體陰性〔-〕及HIV抗體不確定〔±〕。

?符合HIV-1抗體陽性判斷標準，報告“HIV-1抗體陽性〔+〕〞，并按規(guī)定做好檢測后咨詢、保密和疫情報告工作。

?符合HIV抗體陰性判斷標準，報告“HIV抗體陰性〔-〕〞。如果近期有高危行為，如性亂、注射毒品等，或有急性流感樣病癥等情況，為排除因“窗口期〞而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果，建議高危行為后3個月時再做抗體檢測。也可進行HIV-1P24抗原或HIV核酸檢測，作為輔助診斷。?符合HIV抗體不確定判斷標準，報告“HIV抗體不確定〔±〕〞，在備注中應(yīng)注明“3個月后復(fù)檢〞，同時進行以下處理：

(1)隨訪復(fù)檢：每3個月隨訪復(fù)檢1次，連續(xù)2次，共6個月。如果檢測時暴露時間已超過3個月，那么在3個月后隨訪1次即可。將前后2份樣品同時檢測，仍呈不確定或陰性那么報告HIV抗體陰性，如果在隨訪期間發(fā)生帶型進展，符合HIV抗體陽性判定標準那么報告HIV-1或HIV-2抗體陽性。

(2)必要時可做HIV-1P24抗原或HIV核酸測定，但檢測結(jié)果只能作為輔助診斷依據(jù)，確認報告要依據(jù)血清學(xué)隨訪結(jié)果。

?發(fā)出確認報告的同時要做好檢測后咨詢。

HIV抗體確認報告由1名具有高級衛(wèi)生技術(shù)職稱的人員復(fù)核簽字，按原送檢程序反響。如確認對象戶口不屬于本轄區(qū)，確認報告應(yīng)同時抄送HIV感染者戶口所在地的省艾滋病確認中心實驗室。其它系統(tǒng)確認的地方人員〔包括本地和外地〕，也應(yīng)及時向當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門和省艾滋病確認中心實驗室報告。

省艾滋病確認中心實驗室難以確認的樣品，送國家艾滋病參比實驗室確認。同一受檢對象的樣品在不同實驗室得到不一致確實認結(jié)果時，由國家艾滋病參比實驗室和艾滋病確認實驗室審評及技術(shù)指導(dǎo)專家組予以仲裁。

HIV檢測的標準操作要求

HIV檢測不同于其他病原微生物檢測，要求十分嚴格，任何錯誤的診斷，包括假陽性或假陰性，都會對被檢者產(chǎn)生十分重要的影響。因此，HIV檢測，必須嚴格按照國家制定的檢測工作標準進行，整個實驗過程應(yīng)有嚴格的質(zhì)量保證體系。HIV抗體檢測的標準操作要求?標本的采集?血清樣品的采集用注射器抽出一定量靜脈血，室溫下自然放置1~2小時，待血液凝固后再用3000rpm離心15分鐘，吸出血清備用。?抗凝血標本的采集用加抗凝劑的真空采血管或用消毒注射器抽取靜脈血，轉(zhuǎn)移至加有抗凝劑的試管，反復(fù)輕搖，別離血漿和血細胞。根據(jù)實驗要求選用適當(dāng)?shù)目鼓齽渤Ｓ肊DTA〕，如需進行病毒RNA測定，應(yīng)在4~8小時以內(nèi)別離標本。?應(yīng)按臨床采血技術(shù)標準要求，做好個人防護。HIV抗體檢測的標準操作要求?樣品的保存?用于抗體檢測的血清或血漿樣品應(yīng)存放于‐20℃以下，短期〔1周〕內(nèi)進行檢測的樣品可存放于2-8℃。?用于抗原和核酸檢測的血漿和血細胞樣品，應(yīng)凍存于‐20℃以下，長期保存〔3個月以上〕應(yīng)置于‐70℃。用于病毒載量測定的血漿標本應(yīng)于采血后4-8小時內(nèi)置于‐70℃保存。HIV抗體檢測的標準操作要求?樣品的運送?實驗室間傳遞的樣品應(yīng)為血清或血漿。除特殊需要外，不能用全血。?管壁上有明顯的標記〔編號或姓名〕，并附有陽性送檢單。送檢單應(yīng)與標本分開，不能混放。?標本應(yīng)置于帶有蓋帽的試管內(nèi)，防止碰碎，防止樣品流出，?路途較遠或者氣候炎熱時，應(yīng)在2-8℃條件下運送。用于抗體檢測的樣品可在短期內(nèi)〔48小時內(nèi)〕室溫遞送。?特殊情況下可以用特快專遞形式投寄，但應(yīng)保證不會破碎和溢漏。HIV抗體檢測的標準操作要求?樣品的接收

?含有感染性樣品的包裝應(yīng)進行消毒。

?核對標本與送檢單，檢查樣品管有無破損和溢漏，如發(fā)現(xiàn)溢漏，應(yīng)立即進行相應(yīng)處理并報告有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和專家。

?檢查樣品的狀況，記錄有無嚴重溶血、微生物污染等情況。HIV抗體檢測的標準操作要求?樣品的檢測?嚴格按≤全國艾滋病檢測技術(shù)標準≥要求進行。?嚴格按試劑說明書操作，不得擅自更改。?嚴格遵守實驗室操作規(guī)程。?注意防止交叉污染。?檢測程序及流程圖?檢測結(jié)果的報告與處理艾滋病檢測實驗室平安防護?建立平安制度⒈實驗室的設(shè)備、建筑和設(shè)施的平安性應(yīng)通過專家的評審。實驗室墻面、地面、臺面材料應(yīng)耐酸、耐堿、易清潔消毒、不滲漏液體；室內(nèi)應(yīng)有防蚊、防蠅、防鼠等設(shè)備；有條件的實驗室應(yīng)裝有腳踏或感應(yīng)流水裝置，實驗室應(yīng)裝置恒溫設(shè)備，室溫保持在20-25℃。2.建立適用于現(xiàn)有實驗條件的平安標準操作程序。3.每年對平安標準程序及其實施情況進行檢查。4制定意外事故處理預(yù)案，建立意外事故的記錄和報告制度。⒌及時對突發(fā)事件和職業(yè)暴露事故進行調(diào)查、處理和報告。艾滋病檢測實驗室平安防護?人員管理和培訓(xùn)?人員管理?對實驗室環(huán)境進行平安檢查。