第五章-抗-體-制-藥幻燈片

第五章抗體制藥第一節(jié)

概述

1890年Behring和北里柴三郎等人發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。1937年Tiselius等人用電泳法將血清分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β）球蛋白、丙種（γ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。

抗體指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。它是機體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細胞被活化、增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗體活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白，稱為免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）。Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念，所有抗體是Ig，但并非所有Ig分子都有抗體活性。由于病原微生物是含有多種抗原決定族的抗原物質(zhì)，因此制的這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱為多克隆抗體。易出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)。1975年K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。

McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題（障礙）：

A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。需要解決的問題：

A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質(zhì)量。解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80~1/3。第二節(jié)單克隆抗體（MonoclonalAntibody）一、制備單克隆抗體的一般流程

McAb是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。。1、抗原與動物免疫免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動物：BALB/c小鼠和Lou大鼠2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)

基本方法：取適量脾細胞（1×108）與骨髓瘤細胞（2×107~3×107）進行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。

用于細胞融和的骨髓瘤細胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。PEG的相對分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。相對分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亞砜），以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。（1）細胞融合液中的細胞類型：4或5種。（2）如何去除脾-瘤融和細胞以外的細胞？常用選擇性培養(yǎng)基3、篩選陽性克隆與克隆化常用的檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。

4、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定—染色體分析

正常鼠的脾細胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為62~68，NS-1為54~64，大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點。

雜交瘤細胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。

染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；反之，則反。5、單克隆抗體的大量制備（1）體外培養(yǎng)法：可獲得10μg/ml的抗體。多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%--20%胎牛或小牛血清。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達100μg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細胞的生長。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細胞密度可達2×107/ml,收集的單克隆抗體可達400μg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細胞密度可達108/ml。（2）動物體內(nèi)誘生法：可獲得10μg/ml的抗體。常用基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點：操作簡便，比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株。缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。6、單克隆抗體的純化根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法。體外診斷試劑IgG類沉淀處理+親和層析IgM類沉淀處理+凝膠過濾體內(nèi)診斷試劑或治療用藥親和層析+陰離子交換層析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。

動物體內(nèi)誘生法制備的McAb純化的一般程序：

（1）澄清和沉淀處理：a.1000g離心5min，去除沉淀物（紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質(zhì)）b.20000g高速離心30min,去除殘留的小顆粒物質(zhì)c.用0.2μm微孔濾膜過濾，去除細菌、支原體d.飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。

（2）分離A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200作為分離介質(zhì)，可收集到3個峰，最高峰為IgM，另外兩個峰為IgG?？贵w回收率達50~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。B、陰離子交換層析：用于IgG類的分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強度下洗脫下來，其純度很高。IgG2b和IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適用于IgG類。IgG類與蛋白A的結(jié)合與pH有密切的關(guān)系。鼠源性單抗在pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫下IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度和很高，但也有極微量的雜蛋白。二、鼠源性單克隆抗體的改造

目的：一是降低免疫源性；

二是降低相對分子量，增加組織通透性。

原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。

鼠源性單克隆抗體的改造1、人—鼠嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，就能表達出完整的ChimericAntibody.2、改型抗體(Reshapingantibody)：Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補性決定區(qū)(CDR區(qū))。如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中的CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。抗體分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。這種改型抗體也稱CDR移植抗體(CDRgraftingantibody)。3、小分子抗體：基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質(zhì)量僅為原抗體的1/80~1/3。(1)Fab片段抗體：VH+CH1(3)單鏈抗體：VH-Linker-VL(2)FV抗體：VH+VL(4)單域抗體：VH或VL（5）最小識別單位（MRU）：單個CDR區(qū)構(gòu)成

4、雙功能抗體：雙特異性抗體(bispecificantibody,BsAb)。是一種非天然性抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。

5、抗體融合蛋白：從廣義講應(yīng)屬于雙功能抗體范疇。是20世紀90年代發(fā)展的研究領(lǐng)域。類型如下：（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.（2）配基—Ig型嵌合抗體，如IL-2-Ig（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）第三節(jié)基因工程抗體和抗體工程抗體研究的三個階段：①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體；②以1975年K?hler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表。它是抗體研究領(lǐng)域的一次技術(shù)革命，它不用人工免疫動物和細胞融合技術(shù)，完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，而且還能利用基因轉(zhuǎn)移和表達技術(shù)，通過細菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫（Repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。

一、噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法

1、獲取目的基因

2、抗體庫技術(shù)的載體：

3、淘篩（panning）：

4、表達與鑒定：。WesternBlotting免疫印跡與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點1、模擬天然全套抗體庫：抗體文庫可以達到或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)：由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術(shù)。3、可獲得高親和力的人源化抗體：在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體?？贵w診斷試劑和抗體治療藥物

第四節(jié)一、抗體診斷試劑

抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈顯某種反應(yīng)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學(xué)診斷和血型測定，稱為血清學(xué)鑒定?？贵w診斷藥物基本分為三類：血清學(xué)鑒定用的和免疫標記技術(shù)用的抗體制劑，以及體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物習(xí)慣上體外試驗用的稱試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診斷用的稱藥物。

1、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑A、常用診斷血清的品種和用途B、診斷血清的制備步驟a、制備細菌抗原：細菌接種培養(yǎng)收集菌苔-沸水2.5h--制成菌液。b、免疫動物和制備抗體血清：抗原稀釋后免疫動物：家兔、馬、羊、豚鼠。免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數(shù)3-7次，每次間隔3-4d，末次注射后6-8d取血樣測效價，達到要求，即可采血，離心分離血清。C、診斷血清的診斷方法：直接凝集反應(yīng)，鏡檢（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑A、試劑制備原理：紅細胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結(jié)合而使血細胞發(fā)生凝集。B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠獲得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其IgG在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。C、診斷方法：RPHA（reversepassivehemagglutination)反向被動血凝試驗，即用純化的抗體致敏醛化血細胞測定相應(yīng)抗原在V型血凝板上進行，陰性樣品不凝集，血細胞沉積于V型孔底部，呈尖點狀；陽性樣品血細胞凝集成塊狀。

（3）妊娠診斷試劑

婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內(nèi)可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清2、免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機制提供手段。

（1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。（2）免疫酶抗體診斷試劑：用酶標記抗體檢驗抗原的方法a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診斷試劑b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診斷試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑用于原發(fā)性肝癌的輔助診斷f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑用于消化道惡性腫瘤的鑒別診斷（3）放射免疫用抗體診斷試劑

把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。常用的標記抗體試劑：a、HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記d、AFP放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1ng/3、導(dǎo)向診斷藥物由于腫瘤的特異