第六講固定化酶技術(shù)

第六講

固定化酶技術(shù)酶催化具有效率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、速度快等優(yōu)點(diǎn)。但是，酶是蛋白質(zhì)，分離純化過(guò)程復(fù)雜、穩(wěn)定性差，不能反復(fù)使用，價(jià)格較昂貴。目前，酶主要在醫(yī)藥、食品及高附加值化工產(chǎn)品上廣泛應(yīng)用，其它領(lǐng)域則相對(duì)較少。為擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍并降低成本，有效的途徑是實(shí)現(xiàn)酶的多次使用或直接使用細(xì)胞；固定化酶技術(shù)就是在這種思路下發(fā)展起來(lái)的。自上世紀(jì)60年代初就有人研究過(guò)固定化酶，最初是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶，然后是日本的千佃一郎領(lǐng)導(dǎo)的制藥公司，首先將氨基?；腹潭ㄓ谄暇厶悄z中，用于拆分DL-氨基酸；接著召開(kāi)了兩次固定化酶的國(guó)際酶工程年會(huì)。至今已經(jīng)有許多種固定化酶獲得大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，例如固定化青霉素酰化酶生產(chǎn)-6-氨基青霉烷酸（6-APA）。上世紀(jì)70年代出現(xiàn)固定化細(xì)胞技術(shù)。利用固定化大腸桿菌生產(chǎn)L-天冬氨酸一、制備固定化酶的基本策略⒈固定酶時(shí)，必須盡量保證其活性部位的氨基酸殘基不發(fā)生變化；⒉避免導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的操作（如高溫、強(qiáng)酸，強(qiáng)堿等）；⒊盡量在溫和條件下、使酶被其底物或抑制劑飽和或抑制下進(jìn)行。二、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)⒈優(yōu)點(diǎn)容易與底物或產(chǎn)物分離，降低分離成本；可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)、反復(fù)分批或連續(xù)反應(yīng)；穩(wěn)定性較好；反應(yīng)受?chē)?yán)格控制；可組合進(jìn)行多酶反應(yīng)。⒉缺點(diǎn)固定化時(shí)活力損失較大；傳質(zhì)阻力增加，反應(yīng)速率下降；只能用于溶解性底物和小分子。三、酶的固定化方法固定化酶的方法可分為下列三大類(lèi)載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法1.載體結(jié)合法該法將酶與水不溶性載體結(jié)合形成固定化酶根據(jù)結(jié)合的形式不同，可分為：⑴物理吸附法⑵離子結(jié)合法⑶共價(jià)結(jié)合法⑴物理吸附法使酶與載體通過(guò)物理吸附形成結(jié)合?？晒┻x擇的載體很多；無(wú)機(jī)載體有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化鋁、硅膠、羥基磷灰石、金屬氧化物等；天然高分子載體有淀粉、多糖、谷蛋白等；人工合成載體有大孔徑吸附樹(shù)脂、人工陶瓷、疏水載體等。吸附法利用載體表面分子內(nèi)聚力不均勻的特點(diǎn)吸附酶，該法不破壞酶的活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，固定的酶活力回收高；載體與酶的結(jié)合力是物理吸附，結(jié)合力弱，酶易脫落，半衰期短。⑵離子結(jié)合法通過(guò)形成離子鍵固定化酶載體有多糖類(lèi)離子交換劑（DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖、CM纖維素）；合成高分子離子交換樹(shù)脂，例如AmberliteIRA-系列。特點(diǎn)；操作簡(jiǎn)單，處理?xiàng)l件溫和，高級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞，能得到酶活力收率較高的固定化酶；缺點(diǎn)和吸附法相似，受電解質(zhì)濃度影響極大。已有工業(yè)化成功實(shí)例DEAE纖維素及DEAE葡聚糖固定化氨基酸酰化酶用于拆分DL外消旋氨基酸。⑶共價(jià)結(jié)合法利用酶與載體形成共價(jià)鍵固定酶此法載體與酶結(jié)合牢固、半衰期長(zhǎng)。形成共價(jià)鍵的反應(yīng)劇烈，常常引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此酶活力回收一般較低。共價(jià)結(jié)合法使用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼素及其衍生物、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。酶蛋白中，可用于共價(jià)固定酶的功能基有氨基（Lys-ε-NH2和N-末端α-氨基）；羧基（Asp、Glu、C-末端α-羧基）；酪氨酸的酚羥基；半胱氨酸的巰基；羥基（Ser、Thr、Tyr）；His咪唑基；Trp的吲哚基等，其中以氨基和羧基最常用。共價(jià)固定酶的主要化學(xué)反應(yīng)有；?；磻?yīng)、芳化和烷基化反應(yīng)、溴化氰反應(yīng)、重氮化反應(yīng)以及硅烷化反應(yīng)等。①?；磻?yīng)酶蛋白上的氨基與含?；鶊F(tuán)，如?；B氮、酸酐等的聚合物發(fā)生反應(yīng)。上述反應(yīng)的pH通常在7.5—8.5之間，反應(yīng)溫度在4℃左右。②芳化和烷基化反應(yīng)氨基與含有鹵代芳環(huán)或鹵代雜環(huán)的載體作用實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。例如用氯化三嗪活化載體，即將其連接于載體上而活化；多糖類(lèi)可與氯化三嗪連接，例如瓊脂，纖維素及葡聚糖等。該反應(yīng)的速度比?；磻?yīng)慢，且要求未質(zhì)子化的親核試劑，與反應(yīng)的pH關(guān)系很大。通常在pH8.5～9.0下進(jìn)行。③溴化氰反應(yīng)在堿性條件下（pH10—11.5），溴化氰活化多糖的羥基成環(huán)化的亞氨基碳酸鹽，然后與酶蛋白中的氨基形成共價(jià)鍵，使酶固定。該類(lèi)反應(yīng)通常產(chǎn)生三種不同的結(jié)構(gòu)，即在N位與酶連接的氨基甲酸酯；在N位與酶連接的亞氨基碳酸酯；在N位與酶連接的異脲。對(duì)于纖維素載體等多糖直接在糖環(huán)上固定酶可能導(dǎo)致固定和傳質(zhì)阻力大；在堿性條件下可接枝一個(gè)柔性手臂進(jìn)行改善；與β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反應(yīng)，生成對(duì)氨基苯磺酰乙基纖維素（ABSE-纖維素），再重氮化偶聯(lián)。接枝氨基酸的交聯(lián)殼聚糖微球與酶反應(yīng)，接入親水柔性手臂。④重氮化反應(yīng)帶有芳香氨基側(cè)鏈的聚合物用HNO2處理,得到重氮化的芳香族活性載體。在pH8～9時(shí)，該載體與酶蛋白上Tyr的酚羥基、His上的咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，使酶固定。偶聯(lián)的結(jié)果增加了固定化酶的疏水性，不利于在水環(huán)境發(fā)揮催化作用，但似乎有利于在疏水環(huán)境下催化。若要在水環(huán)境中催化，可用多糖作偶聯(lián)劑抵消疏水作用。除Tyr、His以外，蛋白質(zhì)N末端上α-氨基和賴(lài)氨酸上ε-氨基也能與活化載體偶聯(lián)，形成雙偶氮化合物；此外，Arg胍基，Trp吲哚基也能發(fā)生重氮化偶聯(lián)。⑤硅烷化反應(yīng)無(wú)機(jī)含硅載體，例如多孔玻璃或多孔陶瓷，其來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度高而又耐有機(jī)溶劑，是固定化酶的良好載體。將無(wú)機(jī)載體與有機(jī)硅化合物（包括硅烷偶聯(lián)劑）作用，實(shí)現(xiàn)硅烷基化接下來(lái)使烷基活化，最后與酶的氨基反應(yīng)。(6)活性酯法該方法對(duì)于具有游離羧基的載體適用該方法對(duì)于巰基載體適用2.交聯(lián)法

利用雙功能基團(tuán)試劑制備固定化酶的方法。常用的試劑有戊二醛、碳化二亞胺、重氮聯(lián)苯胺和馬來(lái)酸酐共聚物等。⑴戊二醛

戊二醛使賴(lài)氨酸殘基上ε-氨基參與交聯(lián)。⑵異氰酸⑶重氮聯(lián)苯胺雙重氮聯(lián)苯胺

-HCl⑷碳化二亞胺⑸二環(huán)氧化物用兩末端都含有環(huán)氧基團(tuán)的化合物,如1,4-丁二醇二縮水甘油醚，二環(huán)氧辛烷，與具有親核性的基團(tuán)，如羥基、伯氨基或巰基作用（與羥基作用在高pH、氨基在弱堿性）二乙烯砜二乙烯砜是一種高活性的化學(xué)試劑，一般在堿性水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溫度為室溫3.包埋法將酶包裹于凝膠或聚合物半透膜或微膠囊中的方法叫包埋法。該法條件溫和，酶不參與反應(yīng)，活力回收較高。但是，包埋法受限于底物和產(chǎn)物分子體積。用于包埋的試劑多為多糖，如海藻酸鹽，K-角叉菜、瓊脂、乙基纖維素及聚丙烯酰胺凝膠等。方法有微膠囊、相分離、乳化、脂質(zhì)體等。值得注意的是聚丙烯酰胺凝膠，其聚合反應(yīng)如下控制交聯(lián)劑及單體用量可以控制其網(wǎng)格大小。此外，還有光誘導(dǎo)聚合固定化酶等方面的技術(shù)。固定化酶的性質(zhì)活力變化在多數(shù)情況下，比活力低于天然酶，少數(shù)提高。例如羧甲基纖維素固定的胰蛋白酶活力僅為原酶的30%（水解酪蛋白），這主要是固定化使酶活動(dòng)空間、底物、產(chǎn)物擴(kuò)散受限所致。穩(wěn)定性大部分酶固定化后穩(wěn)定性提高，少數(shù)下降熱穩(wěn)定性，提高最適溫度，一般是10℃以上對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高。pH穩(wěn)定性，明顯優(yōu)于游離酶。一般而言，用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值比游離酶高；用帶正電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值比游離酶低；主要是吸附相反電荷離子的電荷平衡造成的。固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶固定化后，結(jié)構(gòu)改變，位阻效應(yīng)、分配效應(yīng)及擴(kuò)散效應(yīng)均發(fā)生改變，對(duì)催化活性有顯著影響。位阻效應(yīng)（屏蔽效應(yīng)）：指由于載體內(nèi)微孔孔穴過(guò)小，或者固定化造成的酶與底物結(jié)合障礙。分配效應(yīng)：指固定化酶與固定化載體間親疏水性及靜電作用差異所造成的底物或產(chǎn)物濃度與溶液主體濃度的差異。擴(kuò)散效應(yīng)底物、產(chǎn)物在固定化酶、載體及主體溶液間擴(kuò)散速率存在的差異以上是影響固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的主要因素，其中酶結(jié)構(gòu)的改變及位阻效應(yīng)的影響可以通過(guò)校正動(dòng)力學(xué)參數(shù)（如Km和Vm）來(lái)體現(xiàn)。分配效應(yīng)則可以利用相平衡理論來(lái)描述，例如用液固界面內(nèi)外側(cè)的底物濃度比（分配系數(shù)）Kp來(lái)定量表示Kp=[Sg]r=R/[SS][Sg]r=R為緊靠固液界面內(nèi)側(cè)底物的濃度，[SS]是緊靠外側(cè)底物的濃度。擴(kuò)散效應(yīng)可用傳質(zhì)理論來(lái)進(jìn)行數(shù)學(xué)描述。引入有效因子來(lái)闡述傳質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響。有效因子Η=（有擴(kuò)散影響時(shí)的實(shí)際反應(yīng)速率/無(wú)擴(kuò)散影響時(shí)的實(shí)際反應(yīng)速率）固定化酶在傳感器方面的應(yīng)用酶?jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c能量轉(zhuǎn)換器(電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)等）密切結(jié)合而成已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)等。目前研究、應(yīng)用最多的是酶電極酶電極用于組分分析，特點(diǎn)是快速、方便、靈敏、精確目前，酶電極已經(jīng)用于各種糖、抗生素、氨基酸、甾體、有機(jī)酸、脂肪、醇類(lèi)、胺類(lèi)、尿素及無(wú)機(jī)酸等分析固定化酶或細(xì)胞在食品工業(yè)中的應(yīng)用糖類(lèi)轉(zhuǎn)化例如葡萄糖異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)化糖生產(chǎn)，乳糖分解氨基酸生產(chǎn)例如L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸等12種醇（酒）類(lèi)生產(chǎn)例如乙醇、異丙醇、正丁醇等固定化細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用有機(jī)酸的生產(chǎn)例如乙酸、檸檬酸、乳酸、赤蘚酸、泛酸、水楊酸、蘋(píng)果