抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素

抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素摘要：力達(dá)霉素屬于烯二煥類抗腫瘤抗生素，可以通過發(fā)酵、生物合成以及化學(xué)合成獲得。力大霉素由一個酸性蛋白和一個烯二煥發(fā)色團(tuán)通過非共價鍵結(jié)合而成，通過多種作用機(jī)制在體內(nèi)外對多種腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用。目前，力達(dá)霉素已經(jīng)進(jìn)入皿期臨床研究，本文介紹了力達(dá)霉素的發(fā)酵及生物、化學(xué)合成方法，抗腫瘤作用和分子作用機(jī)制方面的新進(jìn)展。關(guān)鍵詞：力達(dá)霉素；發(fā)酵工藝抗腫瘤作用Abstract:Lidamycin,amemberoftheenediyneanticancerantibioticsfamily.Canbeacquiredbyfermentation,biosynthesis,chemosynthesis.Lidamyciniscomposedofchromophoreandapoproteinwithnoncovalentbinding.Itexertspotentantitumoractivitiesonavarietyofcancerinvitroandinvivobydifferentmechanisms.LidamyciniscurrentlyevaluatedinPhaseIIclinicaltrials.Inthisreviewwediscussedrecentprogressesinfermentation,biosynthesis,chemosynthesis,molecularmechanismsandantitumoractivitiesoflidamycin.Keywords:Lidamycin;Fermentationprocess;Antitumoractivity-12-—1—刖言力達(dá)霉素(lidamycin,LDM)原名C1027,是從我國湖北省潛江縣土壤中分離出的一株鏈霉菌Streptomycesglobisporus cT027產(chǎn)生的大分子肽類抗腫瘤抗生素，它是采用精原細(xì)胞法篩選得到的，其結(jié)構(gòu)獨特，由一個含110個氨基酸的酸性蛋白(MW10,500)和一個含烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(MW843)通過非共價鍵結(jié)合而成(圖1)，屬于烯二炔類抗腫瘤抗生素。LDM在體外對多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)力的殺傷作用，在體內(nèi)對小鼠移植腫瘤L1210、P388和S180等有明顯的抑制作用，對移植于裸鼠的人體腫瘤也有抑制作用。LDM分子可以進(jìn)行拆分重建，發(fā)色團(tuán)是LDM的活性部分，當(dāng)發(fā)色團(tuán)烯二炔芳構(gòu)化后其活性丟失；蛋白對發(fā)色團(tuán)起保護(hù)作用，游離發(fā)色團(tuán)容易失活，重建LDM與天然LDM活性相同。目前，LDM在國內(nèi)已進(jìn)入11期臨床研究，現(xiàn)就力達(dá)霉素的分子結(jié)構(gòu)與生物合成、化學(xué)合成、抗腫瘤作用及其分子作用機(jī)制等方面的研究工作成果作一綜述。一、力達(dá)霉素的分子結(jié)構(gòu)力達(dá)霉素為新型烯二快類抗腫瘤抗生素，它由1個輔基蛋白和1個發(fā)色團(tuán)成。蛋白部分由110個氨基酸組成，含有2個分子內(nèi)二硫鍵，計算相對分子質(zhì)量為10500U,蛋白質(zhì)部分沒有抗腫瘤活性，但對發(fā)色團(tuán)有穩(wěn)定和保護(hù)作用，并攜帶發(fā)色團(tuán)到達(dá)腫瘤部位。發(fā)色團(tuán)在抗腫瘤活性中發(fā)揮主要作用，發(fā)色團(tuán)由1個9元環(huán)1,52二快232烯核心結(jié)構(gòu)與氮氧雜萘甲酸、氨基毗啶核糖和B2酪氨酸結(jié)合而成。這些結(jié)構(gòu)單元不但參與化合物分子的組成，而且與化合物的生物活性密切相關(guān)。借助核磁共振對輔基蛋白及其與發(fā)色團(tuán)的復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并確定各個結(jié)構(gòu)單位的相對位置，發(fā)現(xiàn)芳構(gòu)化的發(fā)色團(tuán)結(jié)合在輔基蛋白結(jié)構(gòu)中的“疏水口袋”處，它們之間的親和性可能來自輔基蛋白“疏水口袋”區(qū)氨基酸側(cè)鏈與發(fā)色團(tuán)之間形成靜電和疏水作用。二、力達(dá)霉素的發(fā)酵工藝材料和方法1菌株力達(dá)霉素產(chǎn)生菌StreptomycesglobisporusCT027-20(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存,入冊編號CGMCCNo.0704)。培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(g?100mL-1):可溶性淀粉2.0,KNOQ1,KHPO.HO0.05,MgSO.7HO0.05,FeSO0.001,NaCl0.05,瓊脂粉1.5,pH7.0。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g-100mL-1):淀粉1,葡萄糖0.5,血胨0.5,玉米粉1.5,玉米漿0.5,MgSO-7HO0.02,KI0.06,CaO30.4,豆油0.3,pH7.0。培養(yǎng)條件用冷干管中保存的菌種在斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng),28°C培養(yǎng)7?10d,傳2?3代，備用。一級種子用500mL三角瓶內(nèi)裝100mL培養(yǎng)液，從斜面挖塊接種，在轉(zhuǎn)速為190r?min-1的旋轉(zhuǎn)搖床上28C培養(yǎng)48h。二級種子用5000mL三角瓶，內(nèi)裝1000mL培養(yǎng)液，接種量為10%,在振蕩速率為90r?min-1的來回?fù)u床上28C培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)用200L發(fā)酵罐，內(nèi)裝培養(yǎng)液100L,接種量為2%,攪拌速度200r?min-1,28C培養(yǎng)約96h放罐。檢測方法微生物測定法檢測發(fā)酵液中力達(dá)霉素的含量:取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，檢定菌為枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501:，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為5^g-mL-1，用一劑量法測定力達(dá)霉素發(fā)酵液的抗菌活性。用二劑量法測定力達(dá)霉素發(fā)酵提取物的抗菌活性，劑量為12^gmL-1?與3pg?mL-1。HPLC法測定力達(dá)霉素發(fā)酵提取物的含量:精密稱取待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品510mg，用蒸餾水溶解于5mL容量瓶中，用于HPLC測定。色譜條件:Waters高效液相色譜儀(600泵，2487紫外檢測器,Millennium32色譜工作站)；色譜柱：WatersDeltsPakC4柱(319mmX150mm,5pm,30nm);流動相：01025%三氟乙酸2乙腈(23：77);檢測波長:350nm。液相色譜圖見圖2。分別測定力達(dá)霉素樣品及標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)色團(tuán)的峰面積，按照外標(biāo)法計算樣品的效價。乂」一 ~JI人■ i ? ? i I0.002.00 4.006.008.00 10.012.00t/mtn1為輔基蛋白峰(2764min);2為發(fā)色團(tuán)峰(7-752min)圖2力達(dá)霉素典型液相色譜圖精原細(xì)胞法測定力達(dá)霉素抗腫瘤活性:使用體重22?28g的雄性小鼠,分別于2側(cè)睪丸內(nèi)注射被試樣品的溶液。每一種樣品的每一濃度用2?3只動物。注射后2?4d(一般為3d)處死動物,取睪丸固定于Bouin氏液,石蠟包埋切片，切片厚度為5pm,蘇木精2伊紅染色,顯微鏡下觀察結(jié)果。藥物引起的精原細(xì)胞的特異性消失作為陽性。結(jié)果表1為5批中試發(fā)酵液的測定結(jié)果，表2為5批中試發(fā)酵提取物的測定結(jié)果。結(jié)果顯示:5批發(fā)酵液微生物效價平均為450.g?mL-1;5批100L發(fā)酵罐平均每罐產(chǎn)合格的力達(dá)霉素精品517g。表1§批中試發(fā)酵液測定結(jié)果批次抗菌祜性放撤體積兒抗腫痛活性現(xiàn)陽性的稀祥悟數(shù)1種KHNHH24H5KHNHH3390制2DOOQX4330H2KHNHH5385KHNHH表25批中試發(fā)酵提取物測定靖果抗腫瘤活性呈批次羅餓生物法HTLC法現(xiàn)PH性的波度" /地■瞄】/詢■浦■*15.5 14MM)100027.4 914912aoio37.B H4497Raoio43,5 1019I234a(mu34,3 1037]032oiom經(jīng)過多批中試，摸索出了上罐條件，為力達(dá)霉素生產(chǎn)的下游提取提供了充足的發(fā)酵液,經(jīng)過分離純化，積累了足夠的臨床試驗用藥。討論此生產(chǎn)菌種較穩(wěn)定，發(fā)酵培養(yǎng)基較廉價，發(fā)酵工藝過程也很好控制。發(fā)酵液放罐后，由于力達(dá)霉素在常溫下不穩(wěn)定，故發(fā)酵液提取須在低溫(10°C以下)避光條件下迅速提取，以避免活性成分的丟失。力達(dá)霉素3種檢測方法中,HPLC法最準(zhǔn)確，但不能直接測定發(fā)酵液效價；微生物檢定法易操作，經(jīng)濟(jì)實用，但不如HPLC法精確;精原細(xì)胞法可以測定樣品是否具有抗腫瘤活性，但不易操作。故在發(fā)酵液生產(chǎn)階段用微生物法測定含量，原料藥用HPLC法和微生物法測定含量。從表2結(jié)果可以看出，微生物法及HPLC法測定得出的結(jié)果是平行一致的。三、 力達(dá)霉素化學(xué)合成的研在力達(dá)霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)得到解析后，很多實驗室都進(jìn)行著有關(guān)力達(dá)霉素化學(xué)合成方面的工作，希望通過化學(xué)手段可以合成出活性相當(dāng)乃至更強(qiáng)的化合物。根據(jù)逆合成分析,朱錦桃等合成了烯二炔發(fā)色團(tuán)中五元環(huán)狀中間體，并在此基礎(chǔ)上合成了發(fā)色團(tuán)中烯二炔單元的開鏈衍生物，但并未得到閉環(huán)的烯二炔結(jié)構(gòu)。Inoue等在對發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了充分研究之后對發(fā)色團(tuán)的骨架結(jié)構(gòu)和烯二炔的雙環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合成。由于輔基蛋白Gly96的H原子參與發(fā)色團(tuán)芳構(gòu)化后的自身降解，該實驗室還利用同位素氘(D)取代輔基蛋白Gly96的H原子，改造后的輔基蛋白類似物由于動力學(xué)同位素的效應(yīng)減小了發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)降解的速率，增加其穩(wěn)定性。Semmelhack等報道了由甘露糖出發(fā)經(jīng)12步反應(yīng)合成力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)氨基糖結(jié)構(gòu)單元的路線，認(rèn)為合成反應(yīng)的關(guān)鍵步驟在于C24位的內(nèi)部N取代從而引順式氨基以及C25位上烯醇化物的甲基化。四、 力達(dá)霉素的生物合成力達(dá)霉素的發(fā)色團(tuán)核心的烯二炔結(jié)構(gòu)的生物合成途徑一直是人們關(guān)注的焦點。烯二炔結(jié)構(gòu)中首尾相接的乙酸結(jié)構(gòu)單元曾被推測是由不飽和脂肪酸的前體被切割和環(huán)化后形成或是通過聚酮合成途徑，由烯二炔聚酮合成酶(polyketidesynthase,PKS)催化聚線性不飽和聚酮中間產(chǎn)物的生物合成，接著采用一種新穎的環(huán)化機(jī)制而形成烯二炔核心結(jié)構(gòu)。劉文等運(yùn)用PCR方法成功地克隆了力達(dá)霉素脫氧氨基糖代謝途徑中的dNTP2葡萄糖24,62脫水酶基因(sgcA)，并以此為探針，通過基因文庫篩選和染色體步移克隆了完整的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)力達(dá)素的生物合成起源于聚酮代謝途徑，并確定了基因簇編碼1個烯二炔聚酮合成SgcE,排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。除了聚酮合成酶SgcE,劉文等還提出了一系列途徑特異的結(jié)構(gòu)基因分別控制各個結(jié)構(gòu)單元的合成。sgcE2-sgcE11、sgcI、sgcJ、sgcL和sgcF等16個基因負(fù)責(zé)烯二炔核心的合成；sgcA-sgcA6等7個基因sgcA1-sgcA6參與脫氧氨基糖的合成；sgcC-sgcC56等基因參與。-氨基酸的合成sgcD-sgcD6等7個基因負(fù)責(zé)雜萘苯環(huán)的合成。通過各自途徑生物合成的這三個結(jié)構(gòu)單元分別在糖基轉(zhuǎn)移酶(SgcA6)、縮合酶(SgcC5)和酰基轉(zhuǎn)移酶(SgcD6)的催化作用下，與烯二炔核心結(jié)合，構(gòu)成完整的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)分子。對力達(dá)霉素生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因的研究正在進(jìn)行中，通過生物信息學(xué)的分析、在鏈霉菌中的基因中斷實驗以及利用基因工程手段將結(jié)構(gòu)基因的片段克隆至大腸埃希菌表達(dá)載體中并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶學(xué)分析可以確定這些結(jié)構(gòu)基因在力達(dá)霉素生物合成中的相關(guān)功能，并獲取更多生物合成途徑中有關(guān)中間產(chǎn)物和反應(yīng)步驟的信息。目前已陸續(xù)報道了sgcD、sgcA1、sgcC1等結(jié)構(gòu)基因的研究分析結(jié)果。五、力達(dá)霉素的抗腫瘤作用1體外抗腫瘤作用LDM是經(jīng)過精原細(xì)胞法篩選得到的，在體外具有極強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。按克隆生存測定的IC50(半數(shù)抑制濃度)比較，比常用的抗腫瘤藥物如阿霉素(ADR)和絲裂霉素(MMC)等強(qiáng)10000倍以上(表2)。研究室也采用MTT法觀察了LDM對不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用，其IC50值在10-10—10-12mol/L之間，作用均強(qiáng)于絲裂霉素和阿霉素，顯示出LDM對腫瘤細(xì)胞極強(qiáng)的殺傷作用（表3）。同時，我們體外的研究結(jié)果也表明，LDM對多藥抗藥性（MDR）癌細(xì)胞仍顯示強(qiáng)烈的增殖抑制作用，表明多藥抗藥性癌細(xì)胞對LDM無明顯的交叉抗藥性。不同濃度的LDM分別作用于藥物敏感乳腺癌MCF-7細(xì)胞和多藥耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞72h，進(jìn)行MTT分析，LDM的IC50值依次為0.017nmol/L和0.028nmol/L，抗藥倍數(shù)為1.6，多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞對LDM沒有抗性。不同濃度的LDM分別作用于藥物敏感口腔鱗癌KB細(xì)胞和耐長春新堿的多藥耐藥口腔鱗癌KBV200細(xì)胞72h，進(jìn)行MTT分析，LDM的IC50值依次為0.035nmol/L和0.24nmol/L，抗藥倍數(shù)為6.8,多藥耐藥和敏感口腔鱗癌細(xì)胞對LDM的敏感性沒有顯著性差異。不同濃度的LDM分別作用于藥物敏感肝HepG2細(xì)胞和經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并高表達(dá)多藥耐藥基因mdr1的多藥耐藥肝癌HepG2/mdr-1細(xì)胞72h，進(jìn)行MTT分析，LDM的IC50值依次為0.015nmol/L和0.020nmol/L，抗藥倍數(shù)為1.3，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并高表達(dá)多藥耐藥基因mdr1的多藥耐藥肝癌細(xì)胞對LDM沒有抗性。因此，LDM在體外對腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用，與多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞之間不存在明顯的交叉抗藥性。表2力達(dá)霉素對不同人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（克隆形成法比較）緋胞系細(xì)胞來源JC“rnoVL)ADMLDM號很毒素匚新制癌菌素A5491.7X10-'*L5xlO-|T80x1(^12x10^BEL-74O2lixltf*3.ixio-|bND*1WX10-"CNE-2鼻岫掠i.sx^r52.2X10^i.exiaR1.3X10^MGC-80J胃癌L5x瑚2.0xl0'lb1.6x1(^1.3xIO41Wo：未避仃試驗表3LDM對不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比較（MTT法）細(xì)胞系納鹿來源ICsu/inmoUL)LDMMMCADMPANB.胰隙席0.9554240451州】卯D0.^265盛2017BELW30.003J5251.7SMMC-772I肝癟0.0641136.6378BGCB23骨癌0.0034423251.5H460怖疙0.0036551246.2A549怖瘡0.00243492魄3H157肺癌0J2413700322U266務(wù)發(fā)性骨翰痼0.05753ND"25.14SKO-007多發(fā)性骨橫痼0.1585ND"i5Q2*ND：木進(jìn)行試驗.2體內(nèi)抗腫瘤作用LDM在體內(nèi)也能抑制腫瘤的生長，對小鼠移植性腫瘤包括實體瘤和白血病均有顯著抑制作用，對移植于裸鼠的人體肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等均有顯著療效。小鼠體內(nèi)試驗結(jié)果表明LDM對小鼠移植性腫瘤均顯示劑量依賴性的腫瘤生長抑制作用，在最大耐受量(MTD)情況下，LDM(0.1mg/kg)對肝癌22的抑瘤率為84.7%，對肉瘤180的抑瘤率為90%，LDM能顯著抑制小鼠移植瘤白血病L1210的生長，而且能明顯延長小鼠的壽命。裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明，LDM對移植于裸鼠的人肺癌PG顯示劑量依賴性的腫瘤生長抑制作用，在可耐受劑量，LDM的抑瘤率為53-64%。LDM(0.04mg/kg)對移植于裸鼠的胰腺癌SW1990的腫瘤抑制率78%，對移植于裸鼠的胃癌BCG823的腫瘤生長抑制率為72%，對移植于裸鼠的肝癌BEL-7402的腫瘤生長抑制率為68.7%。3聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用研究兩藥相互作用一般采用兩藥相互作用指數(shù)(coefficientofdruginteraction，CDI)進(jìn)行評價。一般情況下，當(dāng)CDI<1時兩藥有協(xié)同作用；當(dāng)CDI<0.7時，協(xié)同作用非常顯著。在體外，LDM和抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用存在幾種不同的作用情況。LDM和順鉑聯(lián)用對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖存在明顯的協(xié)同抑制作用。當(dāng)順鉑劑量為10pmol/L、LDM為0.03nmol/L時，對A549細(xì)胞的生長抑制率分別為74.49%和45.94%，聯(lián)用時為91.41%，CDI<0.7，存在明顯的協(xié)同作用。當(dāng)順鉑劑量為0.3.mol/L、LDM為0.03nmol/L時，對Bel-7402細(xì)胞的生長抑制率分別為25.1%和37%,聯(lián)用時為95%,CDI<0.7,存在明顯的協(xié)同作用。1nmol/LLDM與500nmol/L吉西他濱聯(lián)用，能夠明顯抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖，CDI<0.75，具有協(xié)同抗腫瘤作用。0.1nmol/LLDM與5pmol/Lgefitinib聯(lián)合作用時，能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞H460增殖，其CDK0.70,具有顯著協(xié)同抗腫瘤作用。0.01nmol/LLDM與0.1pmol/Lgefitinib聯(lián)合作用時，能夠明顯抑制表皮樣癌A431細(xì)胞增殖，其CDK0.70，具有顯著協(xié)同抗腫瘤作用。4作為靶向治療的“彈頭”抗體偶聯(lián)物或稱免疫偶聯(lián)物，由抗體或抗體片段與“彈頭”藥物連接而成?？捎米鳌皬楊^”的物質(zhì)有放射性核素、化療藥物與毒素。這些“彈頭”物質(zhì)與抗體連接，分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物與免疫毒素。2000年FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性急性髓性白血病的Mylotarg就是一種免疫偶聯(lián)物，它是由抗CD33分子的單抗和抗腫瘤抗生素calicheamicin連接而成，在抗腫瘤單抗藥物中，是第一個獲批準(zhǔn)上市的單抗偶聯(lián)物。Mylotarg的研究與開發(fā)表明，單抗偶聯(lián)物可以作為一種技術(shù)平臺，即利用特定的“彈頭”藥物分別與不同的單抗進(jìn)行連接，制備靶向性各異的單抗偶聯(lián)物。腫瘤的靶向治療已經(jīng)成為當(dāng)今抗腫瘤研究的一大熱點，而抗體治療是腫瘤靶向治療的一個主要途徑，同時，抗體治療的高效化也是腫瘤治療高效化的一個途徑。采用高效的“彈頭”來制備免疫偶聯(lián)物是實現(xiàn)抗體治療高效化的一個思路。calicheamicin對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性比阿霉素1000倍，LDM對癌細(xì)胞的殺傷作用比阿霉素強(qiáng)10000倍以上，二者都可以作為高效的“彈頭''來制備免疫偶聯(lián)物。事實上，LDM作為高效“彈頭〃的免疫偶聯(lián)物也正在研究階段。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)參與腫瘤的生長和擴(kuò)散過程，在多種腫瘤中過度表達(dá)，是向腫瘤運(yùn)載高效細(xì)胞毒藥物的重要靶標(biāo)。MMPs家族的重要成員IV型膠原酶可以降解基底膜中作為其他組分構(gòu)建支架的IV型膠原，從而有利于腫瘤細(xì)胞破壞和穿透基底膜進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移，并在腫瘤的新生血管形成過程中發(fā)揮重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)因與惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成關(guān)系密切而成為引人注目的研制抗癌藥物的分子靶點。以MMPs家族中與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的成員IV型膠原酶作為抗原，制備了抗IV型膠原酶單抗，該抗體能夠與IV型膠原酶特異性結(jié)合并抑制其活性，由其衍生的抗體片段在腫瘤治療中顯示出良好的靶向性和選擇性。本所腫瘤研究室構(gòu)建了抗IV型膠原酶單抗3G11與LDM偶聯(lián)物3G11-LDM，此偶聯(lián)物保留了單抗3G11與IV型膠原酶和靶細(xì)胞H22細(xì)胞的結(jié)合能力，體外試驗H22細(xì)胞顯示比游離LDM更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用。體內(nèi)3G11-LDM偶聯(lián)物0.05mg/kg和0.10mg/kg對小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率分別為87.8%和97.2%，而游離LDM0.05mg/kg的抑瘤率為67.1%，且3G11-LDM偶聯(lián)物組小鼠的中位生存時間比LDM組明顯延長。3G11-LDM偶聯(lián)物對小鼠移植性肝癌H22的抑瘤作用比LDM強(qiáng)，3G11-LDM偶聯(lián)物在動物實驗中取得的良好療效，為進(jìn)一步研究和開發(fā)以LDM作為“彈頭”的單抗靶向藥物提供依據(jù)。LDM可以與不同的抗體聯(lián)用，也顯示出了較單藥LDM更好的抗腫瘤作用，從而預(yù)示LDM作為免疫偶聯(lián)物的“彈頭”，具有良好的臨床應(yīng)用前景。5抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤細(xì)胞對基底膜的降解中發(fā)揮重要作用，其中以IV型膠原酶(包括MMP-2和MMP-9)尤為重要。金屬蛋白酶活性可被特異性金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMPs)阻斷，已發(fā)現(xiàn)和克隆的TIMPs家族有TIMP-1、2、3、4共4種。在惡性腫瘤中不僅有高水平的MMPs，而且常發(fā)現(xiàn)TIMPs的水平下降，MMPs與TIMPs動態(tài)平衡的失調(diào)可能是決定腫瘤惡性表型的關(guān)鍵因素。LDM可以促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)，抑制MMP-9的表達(dá)，LDM可能通過抑制IV型膠原酶的產(chǎn)生，同時又誘導(dǎo)金屬蛋白酶抑制因子的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出抗侵襲活性。0.025、0.05、0.1mg/kgLDM對小鼠結(jié)腸癌C26肝內(nèi)移植瘤的抑瘤率分別為74.5%、82.3%和92.8%，對脾內(nèi)移植瘤抑瘤率分別為9.2%、25.8%和70.2%，對肝轉(zhuǎn)移灶的總抑制率分別為34.6%、50.7%和76.3%，對大于2mm轉(zhuǎn)移灶的抑制率分別為56.6%、56.7%和90.8%。用LEICAQWINV3圖像分析系統(tǒng)分析肝轉(zhuǎn)移病理切片“以肝臟病理切片中腫瘤轉(zhuǎn)移面積占所檢查肝臟病理切片總面積的比例”作為評價指標(biāo)，0.1mg/kgLDM對肝轉(zhuǎn)移灶的抑制率為71.2%。LDM明顯抑制小鼠結(jié)腸癌在皮下/盲腸/肝內(nèi)和脾內(nèi)移植瘤的生長，對肝轉(zhuǎn)移灶也有顯著抑制作用。因此，LDM具有抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。六、力達(dá)霉素抗腫瘤作用的分子機(jī)制1針對DNA和RNA的損傷作用LDM具有DNA斷裂作用，可以引起單鏈和雙鏈DNA斷裂，并可引起脫堿基斷裂作用。LDM在無巰基還原劑的情況下斷裂雙鏈DNA,且具有核苷酸序列特異性，如CTTTT/AAAAG,ATAAT/ATTAT，CTTTA/TAAAG，CTCTT/AAGAG，尤其對GTTAT/ATAAC特異性更強(qiáng)，內(nèi)含兩處切割位點。LDM發(fā)色團(tuán)結(jié)合并嵌入到DNA雙螺旋分子的小溝中，烯二炔分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成苯環(huán)型的雙自由基中間體，雙自由基通過奪取核苷酸核糖骨架的氫原子，在有氧條件下使核糖基團(tuán)氧化，引起DNA單鏈、雙鏈斷裂或形成脫堿基斷裂；在厭氧條件下DNA互補(bǔ)雙鏈的脫氧核糖自由基與藥物分子共價作用形成DNA的鏈內(nèi)交聯(lián)，引起DNA斷裂。據(jù)報道，LDM切割細(xì)胞內(nèi)DNA的活性是無細(xì)胞環(huán)境中的285倍，對細(xì)胞內(nèi)DNA的切割順序依次為：細(xì)胞內(nèi)的附加體DNA＞線粒體DNA＞＞基因DNA。盡管LDM可以作用于不同形式DNA，但其引起的DNA損傷信號的傳遞卻不依賴于傳統(tǒng)的ATM、ATR和DNA-PK激酶途徑。LDM發(fā)色團(tuán)對RNA也具有斷裂作用。LDM對轉(zhuǎn)運(yùn)苯丙氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA[tRNA(Phe)]具有獨特的活性。在Mg2存在下，tRNA(Phe)保持一種穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，LDM發(fā)色團(tuán)對其反密碼子環(huán)表現(xiàn)出高度的選擇性斷裂作用。LDM能夠抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA合成。應(yīng)用氚摻入法研究表明，LDM能強(qiáng)烈抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402的DNA和RNA合成，對蛋白質(zhì)總體合成沒有顯著作用。2細(xì)胞周期阻滯作用LDM能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，此作用與腫瘤抑制基因p53的狀態(tài)相關(guān)。在p53為野生型的MCF-7細(xì)胞，小劑量LDM誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，在較高劑量情況下，隨著p53和p21表達(dá)的增加，LDM誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1和G2/M期阻滯；同時降低RB和CDK的磷酸化以及cyclinB1、cdk1的蛋白表達(dá)水平。與此相反，LDM僅誘導(dǎo)p53突變型細(xì)胞MCF-7/ADR出現(xiàn)G2/M期阻滯。LDM誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯與Chk1、Chk2、Cdc25C、Cdc2的磷酸化以及Cdc2和cyclinB1的表達(dá)增加相關(guān)，而且，p38MAPK也參與LDM誘導(dǎo)的G2阻滯作用。最近研究表明，靶向細(xì)胞周期“關(guān)卡”的腫瘤治療方式能夠增加DNA損傷劑的細(xì)胞毒作用，如果調(diào)低Chk1的表達(dá)，則能消除LDM引起的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞出現(xiàn)的G2/M期阻滯，并促進(jìn)腫瘤胞凋亡。細(xì)胞周期阻滯在LDM抗腫瘤作用中的機(jī)能還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。3細(xì)胞凋亡、裂亡和衰老樣表型LDM能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和裂亡，并出現(xiàn)衰老樣表型。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)節(jié)的自主控制過程，在機(jī)體發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)的維持中產(chǎn)生生理作用。但是，腫瘤細(xì)胞凋亡是許多抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗腫瘤作用的機(jī)制之一。在凋亡的過程中，凋亡細(xì)胞皺縮、變圓，脫離支持物表面；染色質(zhì)凝集、邊緣化，形成凋亡小體；核小體連接區(qū)被活化的核酸內(nèi)切酶特異水解；DNA修復(fù)被抑制；瓊脂糖電泳出現(xiàn)DNA片段梯；流式細(xì)胞術(shù)檢測往往可觀察到凋亡特異的亞G1期峰。LDM(0.1-10nmol/L)處理早幼粒白血病HL-60細(xì)胞2h，能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，如核固縮、染色質(zhì)凝集和凋亡小體的出現(xiàn)，并誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)典型的DNA片段梯，流式細(xì)胞術(shù)表明，5nmol/LLDM可以誘導(dǎo)79%HL-60細(xì)胞凋亡。一般情況下，可以將細(xì)胞凋亡分為線粒體凋亡和細(xì)胞外凋亡途徑，LDM能迅速激活腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡通路，在2h內(nèi)就引起線粒體中細(xì)胞色素C釋放全細(xì)胞質(zhì)中。同時Bcl-2家族成員中促凋亡成員Bax持續(xù)增加，而抗凋亡成員Bcl-2先增加后減少，p53蛋白在6h顯著增加。Bax蛋白表達(dá)升高與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高有關(guān)，p53蛋白表達(dá)升高與轉(zhuǎn)錄后水平相關(guān)。Caspase抑制劑可以部分抑制LDM的細(xì)胞毒性。細(xì)胞裂亡是一種不同于細(xì)胞凋亡的死亡方式，是指細(xì)胞經(jīng)過一次有絲分裂后才開始死亡的現(xiàn)象。裂亡與凋亡具有各自不同的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)特征。細(xì)胞裂亡的特征主要包括：G1/S期細(xì)胞關(guān)卡缺失或延遲，細(xì)胞阻滯于G2期，有絲分裂異常，細(xì)胞體積變大，形成多核細(xì)胞，DNA出現(xiàn)多倍化，瓊脂糖電泳的DNA泳帶彌散等。低濃度LDM(0.01-1nmol/L)引起人肝癌BEL-7402細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞裂亡，并使細(xì)胞的生長速率均明顯降低，增殖受到抑制；裂亡細(xì)胞呈現(xiàn)出G2+M期延長，細(xì)胞體積增大，多核化，異常染色體核型積累，其特征明顯不同于典型凋亡。LDM引起細(xì)胞形成中心體過復(fù)制，進(jìn)而形成多極紡錘體，導(dǎo)致多極分裂、不均勻分裂等異常有絲分裂的出現(xiàn)。中心體復(fù)制循環(huán)及其數(shù)量不能與其它細(xì)胞周期事件精確匹配是LDM誘導(dǎo)細(xì)胞裂亡的內(nèi)在機(jī)制之一，異常中心體的積累與細(xì)胞G2+M期阻滯有關(guān)。低劑量LDM可降低人肝癌BEL-7402細(xì)胞中p53和p21的蛋白表達(dá)水平，同時增加p38和p-ERK的蛋白表達(dá)，提示LDM引起腫瘤細(xì)胞裂亡與p53、p21表達(dá)下調(diào)而造成的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的下降有關(guān)。在細(xì)胞體積增大這一形態(tài)學(xué)變化上，裂亡細(xì)胞與衰老細(xì)胞有相似之處。衰老相關(guān)的6-半乳糖苷酶(SA-。-gal)的表達(dá)是迄今為止公認(rèn)的衰老相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)之一，雖然研究發(fā)現(xiàn)SA-P-gal陽性細(xì)胞和其陰性細(xì)胞似乎具有相似的裂亡發(fā)生概率，但仍不能排除裂亡與衰老在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上可能存在著某種程度的交叉。0.1nmol/LLDM處理人肝癌BEL-7402細(xì)胞2h后繼續(xù)培養(yǎng)72h，則肝癌細(xì)胞呈現(xiàn)類似于正常衰老的特征：細(xì)胞體積增大，平鋪，粒度上升，液泡空化，SA-p-gal陽性細(xì)胞增多等；1nmol/LLDM作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，可使55.5%的細(xì)胞呈現(xiàn)衰老樣表型，因此，LDM的抗腫瘤作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老相關(guān)。2.4抗血管形成作用腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，因此，抑制腫瘤血管生成是治療腫瘤的一個有效途徑。研究認(rèn)為，腫瘤中血管的來源可能存在三種途徑：腫瘤周圍組織血管以發(fā)芽的方式形成血管；骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞動員形成腫瘤中的新生血管；間充質(zhì)干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤的血管形成。當(dāng)腫瘤不能從鄰近組織中募集到內(nèi)皮細(xì)胞時，骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞將作為主要來源參與腫瘤血管床的新生血管生成，這種情況在正常血管生成則很少發(fā)生。LDM有很強(qiáng)的抑制血管生成作用，在低劑量(0.01微克/雞胚)即可抑制雞胚尿囊膜的血管形成，并且可以阻斷bFGF與受體蛋白結(jié)合，其IC50為2.3X10-6^g/mL。LDM可顯著抑制正常的和bFGF刺激的牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長，IC50值為9.81X10-10mol/L。LDM能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rCMEC)、人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的增殖，濃度為0.1-2nmol/L能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的小管形成、明膠酶分泌以及侵襲和轉(zhuǎn)移。LDM對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖也具有抑制作用。高度侵襲性的黑素瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞具有類似血管生成的能力，其腫瘤微循環(huán)血管通道的形成并不需要內(nèi)皮細(xì)胞的參與，也不依賴于血管生成。因此，以內(nèi)皮細(xì)胞為靶點抑制血管生成的藥物不一定能有效地治療腫瘤?？紤]到這一點，治療的策略應(yīng)該是既要抑制血管生成也要殺傷腫瘤細(xì)胞。LDM兼有強(qiáng)烈的抑制血管生成作用和強(qiáng)烈的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，從這一治療策略而言，LDM的抗腫瘤作用具有本身的優(yōu)勢和特點。5對其他細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的影響(1)力達(dá)霉素對細(xì)胞中K-ras、Akt、NF-kB等信號的影響胰腺癌的發(fā)生是多步驟多基因突變的結(jié)果，胰腺癌的基因突變主要包括K-ras、Her-2、p16、p53、DCP4及BCRA2等，其中K-ras基因突變率為80%。胰腺癌中K-ras的基因突變主要通過ras-PI3K-Akt途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增生、抗凋亡，同時，在復(fù)雜的細(xì)胞信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中K-ras基因突變還影響其他多個信號傳導(dǎo)途徑，使它們共同參與促進(jìn)癌細(xì)胞增生和遷移。腫瘤核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化是腫瘤抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中NF-kB分子一直處于活化狀態(tài)，NF-kB的組成型激活在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。LDM能夠抑制胰腺癌細(xì)胞和腫瘤組織中K-rasmRNA和蛋白的表達(dá)水平，并且隨著LDM作用濃度的提高，抑制作用越來越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；而且，LDM也能抑制胰腺癌細(xì)胞中Akt的磷酸化，劑