新西蘭雜交鮑多糖多肽的提取分離

新西蘭雜交鮑魚生物活性成分提取及活性研究海洋學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)賈芳菲劉慧仲萌萌彭苗逢錫文指導(dǎo)老師張莉摘要：近年來，隨著科學(xué)水平地不斷提高與創(chuàng)新，人們的生活水平也有了很大的提升，并且國內(nèi)外的鮑魚養(yǎng)殖業(yè)也得到了迅速地發(fā)展；越來越多的人買得起鮑魚，鮑魚的消費市場大了，其產(chǎn)品的多元化也逐漸發(fā)展起來，隨之有大量的鮑魚內(nèi)臟出現(xiàn)。鮑魚內(nèi)臟中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素等。本論文以我校侯旭光博士培育的新西蘭雜交鮑魚作為試驗材料，采用多種酶解法提取普通鮑魚臟器和新西蘭雜交鮑粗多糖，并用Sevage法獲得純化多糖，比較了純化多糖與粗多糖對多種菌的抑菌效果；采用NACI和KCI過夜攪拌的方法獲得鮑魚臟器粗多肽，多次離心提純后獲得提純后的多肽，并比較粗多糖、純化多糖、粗多肽、純化多肽的抑菌效果和雜交鮑、普通鮑的抑菌效果差異。試驗采用圓形濾紙片法研究了鮑魚臟器粗多糖和純化后的多糖對4種病原菌的抑制作用，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌，鮑魚多糖對哈維氏弧菌和副溶血弧菌有明顯的抑制作用，對大腸桿菌有輕微的抑制作用，對枯草芽孢桿菌沒有產(chǎn)生抑菌作用。提純后的多糖的抑菌效果明顯強于粗多糖。雜交鮑的多糖多肽的抑菌效果明顯強于普通鮑，證明雜交鮑的臟器多糖多肽活性更強。關(guān)鍵詞：新西蘭雜交鮑鮑魚臟器多糖多肽抑菌1、引言1.1鮑魚的特性鮑魚，（在自然界的分類學(xué)上）它屬于軟體動物門腹足綱原始腹足目鮑科。鮑魚的名稱很多并且各具特色：比如其有名為將軍帽；古代又被稱為鰻；鮑魚殼的內(nèi)壁呈現(xiàn)出銀白色，并且它還具有珍珠般的光澤，鮑魚的這種外殼即為中藥材種類當(dāng)中的一種，所以它又被稱為“石決明”［3］；鮑魚還有很多其他的稱呼如：闊口魚，盤鮑，白冀，明目魚和鮑螺及九孔等等；鮑魚它有且只有半面的外殼，其外殼的表面很粗糙，即寬又扁并且堅硬厚實，因為它外殼的外形就好像是人的耳朵，所以也可以稱它為“海耳”。且說其是鮑魚，奇怪的是它雖名中帶“魚”，但事實上它卻并不屬于真正的魚類，而只是一種原始的海洋單殼軟體貝類［1,4］。鮑魚一般都比較喜歡棲息在水質(zhì)較清澈干凈，水流較通暢且海藻豐富較深的海區(qū)。鮑魚，作為一種傳統(tǒng)且名貴高檔的海珍品，自古以來它就冠有“軟黃金”的妙稱［5,6］。同時，它也榮譽的被評為“四大海味之首”及其“八大海珍之一”。所謂的鮑魚肉也就是人們一般用來食用的部分，通常是指它的腹足，大約有占鮑魚體重的40%。鮑魚的肉質(zhì)非常的鮮嫩爽口，可謂是相當(dāng)?shù)姆拭溃鄂r是特別的濃郁，其具有其他海味所不能夠比擬的特色，所以它能夠久聞名于世。鮑魚當(dāng)中的氨基酸含量，可以說在海洋生物當(dāng)中是最全面的；它所具有的膽固醇和脂肪的含量也是非常低的；并且它還含有蛋白質(zhì)和維生素及微量元素等等?，F(xiàn)今，人類的飲食原料已經(jīng)非常多元化了，而鮑魚就是以它獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，能夠繼續(xù)保持著“唯我獨尊”的高貴身份，受到人們的喜愛，在國際市場上也享有盛名［7-9］。關(guān)于鮑魚的記載有《本草綱目》［10］、《藥典》［11］、《名醫(yī)別錄》［12］等等；鮑魚功效的相關(guān)記載有如：“鮑魚性平，味甘咸”；其具有“明目補虛健腦，養(yǎng)血益胃”等作用；且還可用以治療“青盲雀目，頭痛眩暈”等癥狀。至今，全世界各海區(qū)范圍內(nèi)已經(jīng)被命名的鮑魚就已達到上百種，其中常見的種類大約就有30種，而且分布在我們中國沿海的主要有7種。其中我國南方的雜色鮑及北方的皺紋盤鮑，它們都是我國經(jīng)濟鮑魚種類當(dāng)中的代表品種［1,13］。皺紋盤鮑也是我國鮑科當(dāng)中品質(zhì)最好且價格最高也是最受大眾歡迎的經(jīng)濟種類［14,15］。其中威海本地鮑就屬于皺紋盤鮑，而新西蘭雜交鮑是我校侯旭光博士培育的，皺紋盤鮑和黑足鮑雜交得到的新品種。黑足鮑(Haliotisiris)主要分布于新西蘭周邊海域，個體大、抗逆性強、品質(zhì)優(yōu)良。目前對鮑魚的研究多為皺紋盤鮑，我們特別選取了新西蘭雜交鮑作為重點實驗對象，比較了皺紋盤鮑和新西蘭雜交鮑的活性差異。1.2鮑魚臟器的研究現(xiàn)狀隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，百姓生活水平也在不斷地提高，對物質(zhì)和精神享受的要求也越來越高，以及食品科學(xué)技術(shù)不斷地發(fā)展創(chuàng)新；人們越來越注重飲食生活的營養(yǎng)品質(zhì)。目前，國內(nèi)外關(guān)于鮑魚的研究涉及到了多個方面，包括了增養(yǎng)殖技術(shù)和遺傳育種及加工利用等等，并且也已經(jīng)取得了較好的成果。就因鮑魚它具有特別豐富的食用營養(yǎng)價值及具有很高的藥用價值，所以它深受人們的厚愛，海洋“軟黃金”鮑魚擺置餐桌的頻率日趨高漲；特別是在發(fā)展尤其迅猛的21世紀，所以鮑魚的市場需求量是特別大的。在這種社會狀態(tài)下，也將會極大地刺激鮑魚產(chǎn)品向工業(yè)化和多元化發(fā)展；就目前而言，市場上關(guān)于鮑魚深加工的產(chǎn)品主要有：速凍鮑魚，罐頭鮑魚，干制鮑魚和鮑魚調(diào)味品及鮑魚營養(yǎng)保健品。目前，通過利用各種各樣的提取手段，已經(jīng)從鮑魚中提取出了多種具有生物活性的成分，并且還對提取物的藥效功能進行了研究。如鮑魚多糖［8,16］，鮑魚活素［17］和鮑魚多肽［18］及其鮑魚酒［19］等等。有相關(guān)文獻報道指出，鮑魚體內(nèi)含有抗腫瘤［20,21］和免疫調(diào)節(jié)［22］等功能的活性物質(zhì)。鮑魚的市場需求大了，也就會有大量的鮑魚臟器(鮑魚加工廢棄物)出現(xiàn)，所以隨之被丟棄的鮑魚內(nèi)臟也越來越多，如何去開發(fā)鮑魚臟器中的活性物質(zhì)已經(jīng)引起了人們極大的關(guān)注與興趣。目前，對于鮑魚內(nèi)臟也已經(jīng)有了很多相關(guān)的研究。鮑魚內(nèi)臟中含有一些營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪及碳水化合物等等。所以鮑魚內(nèi)臟可以作為原料，對其進行再次開發(fā)利用，比如可以開發(fā)制備成調(diào)味料或者是多糖保健品等等。因為鮑魚內(nèi)臟中含有價值的物質(zhì)，日本人通常是將鮑魚的內(nèi)臟直接生吃。鮑魚內(nèi)臟中含有的營養(yǎng)物質(zhì)可以被人類直接的吸收，這樣不僅能夠補充人體的營養(yǎng)，又能夠增強人體的抵抗力。有很多研究報道表明鮑魚內(nèi)臟中所含有的多糖物質(zhì)，能夠提高機體的抗氧化能力提高機體的免疫能力；增強機體的抗癌能力；能夠有效的降低機體的血脂和血糖含量等功效。1.3多糖多肽提取工作的研究現(xiàn)狀程婷婷等［23］通過實驗比較了六種酶對鮑魚臟器多糖的提取效果，確定了其中的堿性蛋白酶為最佳用酶并且還確定了此酶的最佳酶解工藝條件：pH為10.0、底物濃度為2.5%、加酶量為2.0%、酶解溫度為45^、酶解時間為3h；在此最佳的工藝條件下，其鮑魚臟器多糖的得率達到了6.5%。國內(nèi)外對鮑魚內(nèi)臟蛋白利用研究的相關(guān)報道較少。稀鹽和緩沖體系的水溶液對蛋白質(zhì)溶解度高、穩(wěn)定性好，是蛋白質(zhì)提取最常用的溶劑。李淑萍等［24］分別采用鹽提蛋白法、堿提蛋白法、Tris-HCl緩沖溶液提蛋白法對鋪道蟻進行蛋白質(zhì)提取。對不同濃度、浸提時間、浸提溫度、固液比Tris-HCl緩沖溶液的pH值進行了研究。最后確定了3種蛋白質(zhì)提取法的最佳工藝條件，堿提蛋白法的蛋白質(zhì)得率最高，鹽提蛋白法次之，最低的是Tris-HCl緩沖溶液提蛋白法。2、 鮑魚多糖的初步抑菌實驗2.1鮑魚多糖的提取鮑魚臟器攪碎干燥制粉，加25倍水，pH10.0，溫度45°C，堿性蛋白酶(20%)水解3h，90°C滅酶10min，冷卻，調(diào)至中性，4000r/rain離心10min，取上清液預(yù)留1/2，即鮑魚多糖提取液I（2） 另1/2的上清液加3倍體積95%乙醇，醇沉12h,離心，取沉淀，冷凍干燥透析加水溶解，pH為2.0,胃蛋白酶（2.0%）,37°C酶解3h,90°C滅酶10min，冷卻，調(diào)至中性，4000r/min離心10min，取上清液預(yù)留1/2，獲得鮑魚多糖提取液II。（3） 1/5的Sevag試劑，劇烈振搖20min，靜置30min，4000r/min離心10min，除去變性蛋白質(zhì)層，取上清液重復(fù)此操作直到無游離蛋白出現(xiàn)為止，反復(fù)凍融3次至無沉淀，冷凍干燥鮑魚臟器精制多糖制成，即鮑魚多糖提取液III2.2鮑魚多糖的抑菌實驗（1） 將鮑魚多糖提取液I配成濃度為0.2mg/L的鮑魚多糖提取液，用打孔器將定性濾紙加工成直徑為6mm的圓形濾紙片，滅菌后浸入濃度0.2mg/L的鮑魚多糖提取液中。浸泡30分鐘。取無菌培養(yǎng)皿，迅速倒入滅菌后冷卻至45C左右的培養(yǎng)基20mL，并快速而輕巧地晃動培養(yǎng)皿，平置冷卻備用。取200pL菌懸液注入冷卻好的培養(yǎng)基上，用涂布棒將其涂抹均勻。用滅菌鑷子夾出含有樣品的濾紙片放在培養(yǎng)基上，每皿貼4片（2片I，2片II），平行做3組。加樣后，枯草桿菌和大腸桿菌置于37C培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑。大腸桿菌產(chǎn)生了輕微的抑菌圈，抑菌圈直徑為6.35mm，枯草芽抱桿菌沒有產(chǎn)生抑菌圈。（2） 制備2216E瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5g、酵母膏1g、檸檬酸鐵0.1g、瓊脂15g和過濾陳海水1000mL，調(diào)pH值為7.6~7.8，分裝在錐形瓶中，封口，高壓蒸汽滅菌50分鐘，取出后趁熱到平板，待冷卻后接種，取得哈維氏弧菌和副溶血弧菌，置28攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后分別挑取一環(huán)已活化好的菌種放入9mLW無菌生理鹽水中，震蕩搖勻，制成一系列菌懸液。將凍于冰箱中的鮑魚多糖提取液I、II取出，溶解后配成濃度為0.2mg/L的鮑魚多糖提取液，用打孔器將定性濾紙加工成直徑為6mm的圓形濾紙片，滅菌后浸入濃度0.2mg/L的鮑魚多糖提取液中，浸泡30分鐘。取無菌培養(yǎng)皿，迅速倒入滅菌后冷卻至45C左右的培養(yǎng)基20mL，并快速而輕巧地晃動培養(yǎng)皿，平置冷卻備用。取200pL菌懸液注入冷卻好的培養(yǎng)基上，用涂布棒將其涂抹均勻。用滅菌鑷子夾出含有樣品的濾紙片放在培養(yǎng)基上，每皿貼4片（2片I，2片II），平行做3組。加樣后，哈維氏弧菌和副溶血弧菌置于28C培養(yǎng)48h，測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑的平均值分別為鮑魚多糖I：哈維氏弧菌：7.4mm，副溶血弧菌6.5mm，多糖II:哈維氏弧菌：9.8mm，副溶血弧菌8.7mm。由以上結(jié)果可得出結(jié)論：多糖2的抑菌效果比多糖1強，對哈維氏弧菌的抑菌作用比對副溶血弧菌強，證明純化后的多糖抑菌效果明顯增強。

圖1鮑魚多糖對哈維氏弧菌的抑制實驗圖2鮑魚多糖對副溶血弧菌的抑制實驗3、鮑魚多糖多肽的抑菌比較實驗3.1鮑魚多肽的提?。?） 新鮮鮑魚去內(nèi)臟，清洗并去除與殼肌連接的中間部分，勻漿后用10倍的冷去離子水洗，離心后棄上清。（2） 鮑魚勻漿組織加入10倍體積的0.6mol/LKCL溶液攪拌24h，5000g離心15min，重復(fù)洗3

次；所得沉淀加10倍體積0.45mol/LNACL溶液攪拌24h,5000g離心15min,重復(fù)洗3次；所得沉淀加10倍體積0.1mol/LNAOH溶液攪拌過夜，去離子水洗至中性，沉淀即為粗膠原纖維。再加10倍體積0.5mol/L乙酸攪拌48h，除去酸溶性膠原蛋白，10000g離心30min;所得沉淀在0.5mol/L乙酸中用胃蛋白酶酶解72h，酶與底物質(zhì)量比為3:20;12000g離心，上清液加入4mol/LNACL使其終濃度為0.8mol/L,冷凍離心，棄上清。沉淀復(fù)溶于0.5mol/乙酸，所得溶液先用0.02mol/LNA2HPO4透析，再用0.1mol/L乙酸透析，凍干即得鮑魚腹足酶促溶性膠原蛋白。3.2抑菌比較實驗基本步驟同多糖抑菌實驗相同。鮑魚臟器粗多糖、粗多肽和純化后的多肽對4種病原菌的抑制作用，包括大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌，比較抑菌效果如下：純化后的多肽〉粗多肽＞粗多糖。I:粗多肽II:純化多肽III:粗多糖表1純化后的多;糖多肽對比分析表—一__粗多肽純化多肽粗多糖大腸桿菌/mm99.87.6枯草芽抱桿菌/mm哈維氏弧菌/mm10129副溶血弧菌/mm11289圖3副溶血弧菌圖4哈維氏弧菌圖3副溶血弧菌圖5大腸桿菌 圖6枯草芽抱桿菌4、普通鮑與雜交鮑的抑菌比較實驗I雜交鮑多糖II雜交鮑多肽III普通鮑多糖W普通鮑多肽表格-1雜交鮑粗多糖雜交鮑粗多肽普通鮑粗多糖普通鮑粗多肽哈維氏弧菌⑴/mm15217.59哈維氏弧菌⑵/mm19.525.19.89哈維氏弧菌⑶/mm19267.59平均直徑/mm17.8248.39表格-1雜交鮑粗多糖雜交鮑粗多肽普通鮑粗多糖普通鮑粗多肽枯草芽抱桿菌⑴/mm10.516.57.57枯草芽抱桿菌⑵/mm10.522.577.5枯草芽抱桿菌⑶/mm11.51476.8平均直徑/mm10.817.777.1表格-2雜交鮑粗多糖雜交鮑粗多肽普通鮑粗多糖普通鮑粗多肽大腸桿菌⑴/mm111776.5大腸桿菌⑵/mm9.5157.56.5大腸桿菌⑶/mm8.514.567.5平均直徑/mm9.715.56.86.8

表格-4雜交鮑粗多糖雜交鮑粗多肽普通鮑粗多糖普通鮑粗多肽哈維氏弧菌/mm17.8248.39枯草芽抱桿菌/mm10.817.777.1大腸桿菌/mm9.715.56.86.8注：副溶血孤菌菌液出現(xiàn)問題，不計入實驗結(jié)果。實驗結(jié)論：1.雜交鮑魚粗多糖抑菌活性高于普通鮑魚粗多糖雜交鮑魚粗多肽抑菌活性高于普通鮑魚粗多肽鮑魚臟器粗多肽抑菌活性略低于粗多糖圖7枯草芽抱桿菌圖8哈維氏弧菌圖7枯草芽抱桿菌圖8哈維氏弧菌圖9大腸桿菌【感悟與展望】在此次科研立項剛開始的一段時間內(nèi)，我們的進展緩慢，感到無從下手，經(jīng)過向張莉老師多次請教并與學(xué)長學(xué)姐及其他科研立項小組同學(xué)的溝通交流后，我們漸漸找到了進步的方向，對實驗的開展也變得越來越得心應(yīng)手。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)了自身的許多不足，比如剛開始時對要用的儀器試劑，總是不能提前全部準備好，因為我們需要的東西涉及多個實驗室，這一問題就變得非常嚴重，后期我們根據(jù)預(yù)實驗記錄，詳細記錄了每一個實驗小節(jié)的儀器試劑，讓實驗過程漸漸變得流暢。在實驗過程中，也遇到了很多困難，經(jīng)常會碰到預(yù)料外的現(xiàn)象，比如72小時攪拌過程中溶液外濺導(dǎo)致實驗失敗，我們通過多次實驗找到了合適的轉(zhuǎn)速，克服了困難。很多時候我們遇到的是我們無法解決的困難，我們遇到了許多熱心幫助我們的人，有了他們的幫助，我們的實驗才得以更加順利的進行。通過此次科研立項，我收獲很大，積累了很多經(jīng)驗，對與本科驗證性實驗非常不同的探索性實驗有了更深理解，處理問題的能力也有了很大提升。做實驗是個耗時費力的事情，實驗結(jié)果往往不盡如人意，但我們非常享受發(fā)現(xiàn)問題并解決的過程，而在過程中我們的實驗?zāi)芰蛻?yīng)變能力也得到了全面提高。本次科研立項就鮑魚臟器多糖多肽的提取工藝和活性做了初步的研究。雖然取得了一定的結(jié)果，但是依然還存在一些問題。實驗中只對常見的幾種細菌做了初步的研究，其對其他種類細菌的作用效果還需要進一步的探究。鮑魚臟器粗多糖多肽的純度不高，所以對鮑魚臟器多糖多肽中能夠起到抑菌的活性成分尚不清楚，還有待于做更深一步的實驗研究。雜交鮑相對于普通鮑有更好的活性，國內(nèi)外對雜交鮑的研究也很少，有待于進一步的開發(fā)利用。【指導(dǎo)老師評語】本課題具有一定的新穎創(chuàng)新性、實用性，經(jīng)過與該組同學(xué)的多次溝通，我認為該組同學(xué)對其所研究的課題，目的明確，前期設(shè)計到位，試驗過程重點難點心中有數(shù)，該組表現(xiàn)出良好的團隊精神，在實驗室的試驗技能操作方面也有了很大的進步，賈芳菲作為科研立項小組負責(zé)人，主持科研工作一年，提高了交流溝通、統(tǒng)籌規(guī)劃、試驗設(shè)計、應(yīng)變等能力。表現(xiàn)良好，希望再接再厲。參考文獻：李太武，蘇秀榕,丁明進，等.鮑的生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.KRESGEN,VACQUIERVD,STOUTCD.Abalonelysin:thedissolvingandevolvingspermprotein[J].BioEssays,2001,23(1):95-103.⑶劉昌衡，袁文鵬,王小軍,等.即食鮑魚加工技術(shù)的研究[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報,2009(33):249-251.董超.鮑魚的加工技術(shù)[J].貯藏加工,2008(10):34.YangXi.Choiceseafeadaboutabalone[J].FisheryGuidetobeRich,2006(5):34-35.易美華，王錫彬.海南鮑營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)的分析研究[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā),1997(12):34-38.苗艷麗，方富永,宋文東.鮑魚內(nèi)臟的酸水解及其梅拉德反應(yīng)產(chǎn)物分析[J].南方水產(chǎn),2009,5(4):54-57.殷紅玲，楊靜峰,李冬梅，等.酶法提取鮑魚多糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(12):158-160.李太武，蘇秀榕,丁明進.皺紋盤鮑中幾種營養(yǎng)成分的測定[J].中國海洋藥物雜志,1995,53(1):47-48.(清)趙學(xué)敏.本草綱目拾遺[M].電子書:436-438.中華人民共和國藥典.2000:68.彭汶鐸，陳啟亮,趙金華.鮑魚酶法提取液對小鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善作用[J].營養(yǎng)學(xué)報,2004,26(1):45-48.高緒生，王琦，王仁波，等.鮑魚[M].遼寧:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2000:96-98.劉明泰，程遠，張艷，等.福建沿海皺紋盤鮑人工育苗技術(shù)研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2010,29(7):416-420.楊慧萍，童圣英,王子臣.皺紋盤鮑淀粉酶和褐藻酸酶的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報,1998,22(4):345-351.陳倩超.鮑魚多糖的提取及抗腫瘤試驗[J].中國現(xiàn)應(yīng)用藥學(xué)，1998,15(1):8-10.方華.鮑魚活素的制備方法[P].中國專利：CN1524563A,2004,9,8.鄒遠東.鮑魚多