《CR技術(shù)應(yīng)用》課件

《CR技術(shù)應(yīng)用》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！PCR是一個(gè)英文簡稱縮寫，通常用于很多學(xué)術(shù)名詞的縮寫，包括生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒错?，電子信息學(xué)的光電導(dǎo)繼電器，計(jì)算機(jī)學(xué)的程序控制暫存器，電子學(xué)的節(jié)目時(shí)鐘參考，口腔行業(yè)的術(shù)語表膜清潔率。PCR診斷細(xì)菌，病毒，寄生蟲檢測腫瘤各種腫瘤檢測研究DNA測序，分析突變，基因克隆人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，表達(dá)圖譜，DNA測序其他…應(yīng)用范圍病原體測定腫瘤研究基因突變及多態(tài)性的研究其他方面FQ-PCR技術(shù)的應(yīng)用FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高準(zhǔn)確性，抑制了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。FQ-PCR只須在加樣時(shí)翻開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，防止了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。FQ-PCR特點(diǎn)由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進(jìn)展。但由于其高靈敏性，實(shí)驗(yàn)操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽性結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義，因此結(jié)模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。1.病原體測定Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒〔HCV〕進(jìn)展了研究。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時(shí)又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時(shí)，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。意大利Gelmini等用FQ-PCR技術(shù)檢測乳腺癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因?yàn)閰⒄仗剿髯钫_實(shí)驗(yàn)條件，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在28～31之間時(shí)，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們在此條件下擴(kuò)增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Southern印跡結(jié)果和已報(bào)告的競爭性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性〔n=25，r=0.94，P〈0.01〕。2.腫瘤研究美國Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術(shù)對正常痘病毒多態(tài)性進(jìn)展了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結(jié)合的引物，并設(shè)計(jì)兩個(gè)有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，順利地把有此單核苷酸差異的兩個(gè)痘病毒株進(jìn)展鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。3.基因突變及多態(tài)性的研究日本Isono利用FQ-PCR進(jìn)展葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)展葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的葉綠體成熟過程聯(lián)系起來。1998年美國Higgins等還建立起一套用熒光探針檢測鼠疫纖溶酶原激活基因〔pla〕的實(shí)驗(yàn)方法。4.其他方面綜上所述，F(xiàn)Q-PCR作為一種核酸定量技術(shù)，應(yīng)用較多且較成熟的主要是在病原體檢測方面，其優(yōu)越性在此方面也得以充分表達(dá)。因此將該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于臨床，具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面，尤其是基因表達(dá)的研究，該技術(shù)目前應(yīng)用的還較少，在此方面加強(qiáng)研究應(yīng)用，將會有廣闊的前景。

摘要熱不對稱性PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)利用3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的嵌套特異性引物分別和簡并引物組合進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇恰當(dāng)退火溫度對目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TAIL-PCR技術(shù)作為一種使用技術(shù)簡單易行，反應(yīng)高效靈敏，產(chǎn)物特異性高，重復(fù)性好，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)片段，已經(jīng)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。TAIL-PCR技術(shù)是以基因組DNA作為模板，利用依照目標(biāo)序列旁的序列設(shè)計(jì)的3個(gè)較高退火溫度的嵌套特異性引物(specialprimer,SP)，和一個(gè)較短且Tm值較低的隨機(jī)簡并(arbitrarydegenerate,AD)引物組合，通過3輪具熱不對稱的溫度循環(huán)的分級反響來進(jìn)展PCR擴(kuò)增，獲得序列的側(cè)翼序列TAIL-PCR技術(shù)原理TAIL-PCR包括3輪PCRTAIL-PCR反響條件反映Reaction循環(huán)數(shù)Cycle-No溫度(℃)Temperature(℃)時(shí)間(s)Time(s)溫度(℃)Temperature(℃)時(shí)間(s)Time(s)溫度(℃)Temperature(℃)時(shí)間(s)Time(s)第一輪Primary第二輪Secondary第三輪Tertiary1511012110120193949494949494729494947294949472603030303030303003030303003030306009563*44636344-636344-636344-606060606060-606060-606060--727272727272-727272-727272--150150150150150150-150150150-150150150-注*：25℃保持180s后以0.3℃/s升溫至72℃TAIL-PCR引物設(shè)計(jì)和一般的PCR反應(yīng)相比，TAIL-PCR反應(yīng)對引物的要求較高，引物的設(shè)計(jì)很是重要。特異性引物和簡并引物的選擇直接影響擴(kuò)增的效果。特異引物設(shè)計(jì)：3個(gè)嵌套的特異性引物長度一般在20~30bp之間，Tm值一般設(shè)為58~68℃。SP1、SP2和SP3之間最好相距100bp以上以便在電泳時(shí)更容易區(qū)分3輪PCR產(chǎn)物。若是設(shè)計(jì)T-DNA插入序列的引物，為了保證T-DNA在轉(zhuǎn)移過程中不被切去，至少要保證SP3的3'端距T-DNA的邊界在l00bp左右。簡并引物設(shè)計(jì)：簡并引物是按照物種普遍存在的蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)的，相對較短，長度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之間。AD引物是否最佳與它的簡并度、引物長度和核苷酸序列組成有很大關(guān)系。為了更好的與目標(biāo)序列退火：首先，盡量選擇簡并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)，如蛋氨酸和色氨酸均只有一個(gè)密碼子，核苷酸的簡并性一般選擇在64~512倍之間；其次，充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性；最后，盡量避免3'末端的簡并，對于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3'末端不要位于密碼子的第三位；另外，在一些多義位置可以使用脫氧次黃嘌呤代替簡并堿基。TAIL-PCR反應(yīng)條件在整個(gè)TAIL-PCR中，引物設(shè)計(jì)固然重要，三個(gè)循環(huán)PCR的各組分的工作濃度也是不可忽視的。經(jīng)典的TAIL-PCR中，第2次和第3次反應(yīng)的模板都由前一次PCR產(chǎn)物按1/1000進(jìn)行稀釋所得，但在實(shí)際的PCR反應(yīng)中，為了得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為優(yōu)化每一輪產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)是必要的。另外在反應(yīng)體系中，特異性引物的濃度與普通的PCR相同，簡并引物的濃度要高，一般為2.0~5.0滋mol/L，以滿足引物的結(jié)合效率反應(yīng)成分Reactioncomponents

第一輪反應(yīng)

Primaryreaction

體積(滋L)濃度Volume(滋L)Concentration

第二輪反應(yīng)

Secondaryreaction體積(滋L)濃度Volume(滋L)Concentration

第三輪反應(yīng)

Tertiaryreaction體積(滋L)濃度Volume(滋L)Concentration10伊LAPCRbuffer(Mg2+)

dNTPs(2.5mmol/L)SP(10pmol/L)AD(20pmol/L)TaKaRaLATaq(5U/L)TemplateddH2OTotal2.502.000.503.000.251.0015.7525.001×0.20mol/L0.20mol/L2.40mol/L1.25U2.502.000.502.500.251.0016.2525.001×0.20mol/L0.20mol/L2.00mol/L1.25U5.04.01.06.00.61.032.450.01×0.2mol/L0.2mol/L2.4mol/L1.5UTAIL-PCR反應(yīng)混合液組成TAIL-PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)TAIL-PCR優(yōu)點(diǎn)：(1)操作簡便，省時(shí)：直接用基因組DNA為模板，而且TAIL-PCR對模板的數(shù)量和純度的要求不高，只需幾個(gè)ng的DNA即可。整個(gè)TAIL-PCR反應(yīng)可在一天內(nèi)完成，可以快速獲得目標(biāo)片段，簡便快捷。(2)成本低：傳統(tǒng)基因克隆中的RT-PCR、RACE技術(shù)對實(shí)驗(yàn)技術(shù)和樣品要求高，RNA的提取、純化、反轉(zhuǎn)錄等操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)錢，而TAIL-PCR只需要設(shè)計(jì)幾個(gè)嵌套特異引物和簡并引物即可，大大降低了成本。(3)高特異性和高靈敏性：用短的簡并引物和長的特異性嵌套引物相組合，通過不對稱的溫度循環(huán)和分級反應(yīng)，使反應(yīng)體系有利于特異引物的擴(kuò)增，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物中目的片段占絕對優(yōu)勢，反應(yīng)產(chǎn)物可以直接用做探針標(biāo)記和測序模板，這一點(diǎn)是靶基因步移PCR和單引物PCR(Parksetal.,1991)無法與之相比的(非特異性產(chǎn)物帶來的高背景)。使用任何一個(gè)AD引物，在60%~80%的反應(yīng)中都能夠產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，運(yùn)用不同的AD引物就能夠有效地?cái)U(kuò)增到目標(biāo)片段TAIL-PCR缺陷：(1)反應(yīng)條件設(shè)置要求精細(xì)，因?yàn)門AIL-PCR是3輪連續(xù)的嵌套的反應(yīng)。若是其中一輪出現(xiàn)失誤，將會直接影響下一循環(huán)的工作，以至得不到理想的結(jié)果。(2)TAIL-PCR反應(yīng)需要較多的引物組合，因?yàn)椴煌腁D引物具有不同的結(jié)合位點(diǎn)。(3)TAIL-PCR反應(yīng)不是每次都有陽性結(jié)果。因?yàn)锳D引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)，在個(gè)別側(cè)翼序列的擴(kuò)增中，即使使用不同的簡并引物也難以獲得陽性結(jié)果。TAIL-PCR技術(shù)在植物基因克隆上的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景傳統(tǒng)的植物基因克隆方法大多具有實(shí)驗(yàn)周期長,工作量大且技術(shù)步驟煩瑣等不足。圖位克隆技術(shù)建立在遺傳分析和基因定位的基礎(chǔ)上，但這一技術(shù)耗工耗時(shí)；基因組減法技術(shù)，要求缺失突變體與其未缺失同源親本只有1~2個(gè)DNA片段的差異，若2個(gè)材料的核DNA差異不顯著，很難獲得我們需要的目的基因；轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法首先需要一個(gè)已克隆好的功能轉(zhuǎn)座子，插入突變使某一基因失活，然后進(jìn)行植物雜交并篩選突變體，并且還需鑒定突變體是否由轉(zhuǎn)座子插入而產(chǎn)生，實(shí)際操作比較煩瑣?！艚陙?，TAIL-PCR技術(shù)以其上述獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)逐漸被廣泛應(yīng)用于植物基因側(cè)翼序列的克隆及獲取全長的研究中，目前已成功的從P1、YAC和BAC克隆中獲得插入末端的DNA序列和擬南芥的T-DNA側(cè)翼序列(LiuandWhitter,1995;LiuandHuang,1998)。隨著TAIL-PCR方法的優(yōu)化，應(yīng)用更加廣泛。宋達(dá)峰等(2005)年將第三輪反應(yīng)中的普通的PCR循環(huán)換用熱不對稱PCR循環(huán)，以改進(jìn)的TAIL-PCR方法從3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草后代植株中成功擴(kuò)增出T-DNA插入位點(diǎn)的全長335bp的側(cè)翼序列。Wang和Gao(2006)通過改進(jìn)的TAIL-PCR方法克隆非洲紫羅蘭(Saintpliaionantha)兩側(cè)對稱栽培種中CyC類基因的5'未知序列，并進(jìn)而從兩側(cè)與輻射對稱栽培種中分離得到苦苣苔科(Gesneriaceae)中第一組完整基因：SiCYCI