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文檔簡介
實(shí)驗(yàn)六家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)血凝和血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination
and
Hemagglutination
InhibitionAssay,
HA
and
HI)家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)
臨床癥狀和病理變化只能作為疾病診斷的一個(gè)指征,不能作為確診的依據(jù)。病原檢測抗體檢測分子診斷鑒別診斷病毒分離鑒定病毒的分離鑒定:是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。樣品采集培養(yǎng)系統(tǒng)分離方法病毒鑒定傳代細(xì)胞原代細(xì)胞雞胚糞便、腸內(nèi)容物泄殖腔、氣管拭子病變組織接胚離心取上清勻漿或懸浮生物學(xué)特征致病性試驗(yàn)血凝試驗(yàn)單抗分群
接種途徑1、絨毛尿囊膜接種(法氏囊、傳喉)2、尿囊腔接種(禽流感、新城疫、傳支)(鴨胚或鵝胚尿囊腔:鴨肝炎、鴨瘟、EDS-76)3、卵黃囊接種(法氏囊、EDS-76)4、羊膜腔接種 正粘病毒和副粘病毒(流感、腮腺炎等病毒)
尿囊腔接種主要用于正粘V和副粘V,如流感V、新城疫V的分離和增殖。1、選用9-11日齡的雞胚,畫出氣室和胚位2、在氣室接近胚體處用碘酊和酒精進(jìn)行消毒3、用打孔器穿一小孔,將注射器沿小孔插入0.5-1.0cm,注入0.1-0.2ml接種物4、用石蠟封口,并置孵卵箱中孵育,每天翻卵并檢卵一次,24h內(nèi)死亡者廢棄。絨毛尿囊膜接種主要用于痘V和皰疹V的分離和增殖。1)取10-12日齡雞胚,畫出氣室部,消毒2)在氣室端的卵殼上開一1.5×1.5cm的口3)用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜4)滴入接種物5)用膠布或透明膠紙封閉切口
收毒收毒前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時(shí)以上,凍死胚胎,防止出血。根據(jù)接種途徑的不同,收獲相應(yīng)的材料1、絨毛尿囊膜接種 收獲接種部位絨毛尿囊膜2、尿囊腔接種 收獲尿囊液(5-8ml)3、卵黃囊接種 收獲卵黃囊或胚體4、羊膜腔接種 收獲羊水(0.5-1ml)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康难脱种圃囼?yàn)的原理。實(shí)驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定。了解HA和HI實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用(定性,定量)。能凝集紅細(xì)胞的禽的病原禽流感病毒新城疫病毒傳染性支氣管炎病毒(胰酶,磷脂酶C)EDS76副雞嗜血桿菌雞毒支原體二、實(shí)驗(yàn)原理(一)血凝試驗(yàn)(HA)一些病毒能夠促使動(dòng)物如雞、鵝、豚鼠和人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集,叫做血凝試驗(yàn)。HA的原理圖++++++++++-血凝試驗(yàn)結(jié)果判定1:21
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1:212血凝價(jià):能使紅細(xì)胞產(chǎn)生50%凝集的病毒最高稀釋度。(一個(gè)血凝單位)VaVbVcVd(二)血凝抑制試驗(yàn)(HI)當(dāng)病毒懸液中加入特異性抗體時(shí),這種紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象就被抑制,稱紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),即血凝抑制試驗(yàn)。HI的原理圖三、實(shí)驗(yàn)材料雞新城疫病毒:雞新城疫弱毒株(Lasota)接種雞胚、收獲尿囊液制備。雞紅細(xì)胞:采集健康雞血液,以阿氏液抗凝,以生理鹽水洗滌3~5次,將血漿、白細(xì)胞等充分洗去,用生理鹽水配置成1%紅細(xì)胞懸液使用。0.85%生理鹽水。被檢血清,采自被檢雞的健康血清。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)血凝試驗(yàn)(HA)1~12孔加入50μl生理鹽水;第1孔加50μl病毒懸液,倍比稀釋到第10孔;1~12孔中加入1%的紅細(xì)胞50μl;震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。病毒液的血凝價(jià)是1:2???滋?/p>
1稀釋倍數(shù)
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RBC1:22
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50棄50μl血凝試驗(yàn)(HA)震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。Agglutination
patterns
observed
with
HAI
plate
tilted
at
a60°
angle.Diana
L.
Noah
et
al.
Clin.
Vaccine
Immunol.
2009;16:558-566(二)血凝抑制試驗(yàn)(HI)1~11孔加入25μl生理鹽水;第1孔加待檢血清25μl,倍比稀釋至第10孔;1~11孔加25μl
4個(gè)血凝單位的病毒懸液;1~12孔中每孔加入1%的紅細(xì)胞50μl;震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果;紅細(xì)胞凝集100%的抑制作為結(jié)果判定的終點(diǎn)。如果血凝價(jià)為1:28
(256個(gè)單位),那么4個(gè)血凝單位就是將病毒液進(jìn)行26倍(64倍)稀釋10/640=
1/26,所以病毒原液取10μl,生理鹽水取630μl;4個(gè)血凝單位病毒懸液體積:25μl/孔×12孔=400μl??滋?/p>
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Virus
血清稀釋倍數(shù)
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1:210生理鹽水25
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50棄25μl血凝抑制試驗(yàn)(HI)震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定血清對照孔:RBC沉于孔底,無自凝病毒對照孔:凝集RBC對照孔:無自凝
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