腫瘤的分子生物學(xué)檢驗

腫瘤的分子生物學(xué)檢驗第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤標志物的研究歷史第1階段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年Abelev

AFP1965年Gold&Freeman

CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年Koprowski

CA19-9（1116-NS-19-9）1981年Bast

CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標志腫瘤基因標志第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月一、原癌基因(oncogene，onc)及其表達產(chǎn)物的作用

1、定義：

原癌基因是指人類或其他動物細胞（以及致癌病毒）固有的一類基因，能誘導(dǎo)細胞正常轉(zhuǎn)化并使之獲得新生物特征的基因總稱。原癌基因包括病毒癌基因（v-onc）和細胞癌基因（c-onc）兩種，它們在正常情況下以非激活的形式存在，故稱原癌基因。負責(zé)調(diào)控正常細胞的生命活動，包括細胞增生、生長因子信號傳遞、細胞周期進展、細胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯誤或功能喪失時，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜毎D(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因。第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月2、特點：

（1）v-onc是病毒基因組中特殊的核苷酸序列，能

引起細胞轉(zhuǎn)化

（2）c-onc是存在于正常細胞基因組中的癌基因，

在正常情況下處于靜止或低表達的狀態(tài)，不

僅對細胞無害，而且對維持細胞正常功能具

有重要作用，但在異常表達時，其產(chǎn)物可使

細胞無限制分裂

第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞癌基因與病毒癌基因核酸序列有同源性即它們的DNA序列是相對應(yīng)的，表達產(chǎn)物也基本相同第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞癌基因的作用：

通過其表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的，負責(zé)調(diào)控正常細胞的生命活動，包括細胞增生、生長因子信號傳遞、細胞周期進展、細胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。

第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月二、癌基因定義：原癌基因在進化上高度保守，負責(zé)調(diào)控正常細胞的生命活動，包括細胞增生、生長因子信號傳遞、細胞周期進展、細胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯誤或功能喪失時，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜毎D(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月三、原癌基因的激活機制

原癌基因具有正常的生理功能，被激活時又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。

現(xiàn)已證實

射線輻射

化學(xué)致癌劑

病毒感染

第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)原癌基因點突變(pointmutation)

癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個核苷酸發(fā)生突變，使其表達蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細胞的活性mutation第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)原癌基因獲得外源啟動子而激活

腫瘤細胞中原癌基因的表達水平可以其轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的含量來表示

在原癌基因的上游插入外源性啟動子或增強子可激活原癌基因，使其表達產(chǎn)物增多

病毒的增強子常位于5’端的長末端重復(fù)序列(1ongterminalrepeat，LTR)內(nèi)。如果增強子插入到原癌基因的附近或遠處，均使之激活，促使癌基因的表達比正常表達增高幾十甚至上百倍

第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)原癌基因甲基化程度降低而激活

DNA分子中的甲基化(methylation)對阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腺癌和小細胞肺癌的細胞中，ras基因的DNA甲基化水平比其鄰近的正常細胞明顯偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)原癌基因的拷貝數(shù)增加

基因擴增(amplification)：

某些癌基因通過一些機制在原來的染色體上復(fù)制多個拷貝，超出了正常細胞的癌基因劑量，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增加，從而使細胞正常功能紊亂

例如：

人視網(wǎng)膜母細胞瘤：N-myc擴增了10-200倍，相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物也都大量增加第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

(五)基因易位或重排使原癌基因激活

基因易位（translocation）

基因重排（rearrangemant）：

有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對靜止狀態(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達產(chǎn)物顯著增加而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生

第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細胞白血病的發(fā)生

第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、抑癌基因

抑癌基因(suppressergene)又稱抗癌基因(anti-onc)，是存在于正常細胞內(nèi)的一類可抑制細胞生長的基因，并有潛在抑癌作用。當這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時，可引起細胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生

第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）抑癌基因及其表達產(chǎn)物

抑癌基因與調(diào)控細胞分裂和分化過程相關(guān)，可能與生長因子、某些蛋白激酶類活性密切相關(guān)，只是抑癌基因給予細胞的信號與原癌基因相反第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）抑癌基因失活機理

1、視網(wǎng)膜母細胞瘤(retino-blastoma，Rb)

（1）特點：

★基因組成：27個外顯子，3-17外顯子區(qū)域是基

因重組和突變的熱點

★編碼：p105的蛋白質(zhì)，其有結(jié)合DNA的活性，

可受多種激酶系統(tǒng)催化而發(fā)生磷酸化第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）作用：

不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全消失。非磷酸化的Rb可防止細胞增殖，當DNA腫瘤病毒抗原結(jié)合了非磷酸化的Rb時，Rb的活性就受到抑制，使細胞轉(zhuǎn)化為無限增殖狀態(tài)，形成腫瘤第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月對于大量來自視網(wǎng)膜母細胞瘤的Rb基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)Rb基因完全或部分發(fā)生缺失；另一些Rb腫瘤中，基因完整，但序列分析顯示有一個突變，它常發(fā)生于剪接點上，由于這一變異導(dǎo)致RbmRNA組裝時有外顯子被漏掉，因而產(chǎn)生異常Rb蛋白質(zhì)

第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

抑癌基因又稱為隱性癌基因

基因1基因2原癌基因MW腫瘤抑癌基因MW

MM腫瘤第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）p53基因

★特點：17p13，11個外顯子，10個內(nèi)含子

★編碼：393個氨基酸，p53第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月★作用：產(chǎn)物能結(jié)合DNA和被磷酸化。

（1）抑制腫瘤細胞停滯在修復(fù)前期不能進入S期復(fù)制DNA而促使細胞凋亡第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月野生型p53的蛋白質(zhì)

p53下調(diào)bcl-2而上調(diào)bax，促進細胞凋亡過程。向丟失p53等位基因的腫瘤細胞中導(dǎo)入野生型p53就會使腫瘤細胞凋亡第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

正常細胞的生長增殖由兩大基因調(diào)控正調(diào)控信號：促進細胞生長和增殖，并且阻止其發(fā)生終末分化—癌基因

負調(diào)控信號：促進細胞成熟，向終末分化，最后凋亡（apoptosis）—抑癌基因

兩種信號保持著動態(tài)平衡，對正常細胞的生長、增殖、死亡精確地調(diào)控，當平衡被破壞，正調(diào)控信號基因功能過盛或負調(diào)控信號基因失活，導(dǎo)致細胞增殖調(diào)控的混亂而使細胞惡變第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

原癌基因的激活

1、ras基因的變異

2．myc基因的變異抑癌基因的失活

1、Rb基因的失活

2、p53基因的失活

3、其他：

BRCA1和BRCA2：與遺傳性高發(fā)乳腺癌相關(guān)的基因，與卵巢癌的發(fā)生也緊密相關(guān)

第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月五、檢測方法：

1、PCR／ASO探針法(PCR-allele-specific

oligonucleotide）

被檢基因片段經(jīng)PCR擴增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交。由于長度為20個堿基左右的探針中僅1個堿基的差異便會使其Tm值下降5.0~7.5℃，因此通過嚴格控制雜交條件，可以使PCR產(chǎn)物與完全互補的探針進行雜交，也即野生型序列的產(chǎn)物僅與野生型探針雜交，含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交。根據(jù)有無雜交信號可判斷被檢擴增片段中是否帶有突變點。

第27頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月2、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析

聚合酶鏈式反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)（PCR—RFLP）分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上，使酶切位點增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測某一致病基因已知的點突變，進行直接基因診斷，也可以此為遺傳標記進行連鎖分析進行間接基因診斷。

第28頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月3、PCR-SSCP、測序等單鏈DNA分子具有特定的二級空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA第29頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月4、變性梯度凝膠電泳(DGGE)在設(shè)計引物時應(yīng)使被擴增的靶基因片段的