菌種的復蘇傳代及保存標準程序

菌種的復蘇傳代及保留標準程序目的：成立菌種的復蘇、傳代及保留標準程序。范圍：合用于檢定用菌種的復蘇、傳代及保留的操作。職責：質管部生物測定人員對本規(guī)程的實行負責。內容：菌種的復蘇與傳代操作均應在生物檢定室陽性比較間或專用超凈工作臺內進行。操作中使用過的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗結束后經121℃30分鐘高溫滅菌辦理。菌種的復蘇凍干菌種的復蘇檢定用標準菌種，由中國藥品生物制品檢定所供給，為冷凍干燥菌種(0代)。使用前需將其復蘇。準備：①器具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。②培育基：依據菌種的性質選擇適合的液體培育基（營養(yǎng)肉湯培育基或改進馬丁培育基）、營養(yǎng)瓊脂（或改進馬丁瓊脂）斜面數支。③消毒液：75%酒精、碘酒、%新潔爾滅或84消毒液等。操作：將準備妥的冷凍菌種管、滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、培育基移入工作臺。用砂輪將凍干菌種管頸部挫出刻痕，再75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內待干。點燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱，用滅菌滴管汲取液體培育基少量，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口翻開后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內。另取一支滅菌滴管，在火焰旁汲取合用液體培育基少量，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促進溶解，隨即吸出管內菌液，接種至液體培育基內。用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培育基上。將已接種的液體培育基及瓊脂斜面培育基置規(guī)定溫度下（一般細菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培育24h。拿出培育物（第1代），認真察看菌苔形態(tài)、有無雜菌，必需時涂片、革蘭氏染色鏡檢，若呈典型菌落即可應用。如發(fā)現菌型不典型，可進行平板分別單菌落。為保證工作用菌株的傳代次數不超出5代，并減少購置凍干菌種的次數，可在對凍干菌種復蘇的同時制備部分菌懸液（第1代）冷凍保存，并將此凍存菌液復蘇后的第2代培育物凍存收藏。準備：①凍存保護液（40%無菌甘油）及滅菌凍存管。②細菌凍存液：由液體培育基與凍存保護液按1：1比例混勻制成。按操作，將凍干菌復溶后，汲取菌懸液加入到細菌凍存液中，混勻。按1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。注明菌名、編號及凍存日期等。置-20℃或-80℃條件下冷凍保留。制備第2代凍存菌懸液時，可用接種環(huán)直接刮取第1代凍存菌懸液復蘇后轉種至瓊脂斜面或平板培育基上生長的純菌落，再接種至細菌凍存液中，混勻后按凍存。凍存菌懸液的復蘇：準備：①器具：滅菌1ml滴管、酒精燈、接種環(huán)。②培育基：依據菌種的特征選擇適合的液體培育基（如營養(yǎng)肉湯培育基10ml、硫乙醇酸鹽流體培育基12ml或改進馬丁培育基10ml等）、瓊脂斜面或平板培育基。③消毒液：75%酒精、%新潔爾滅或84消毒液等。操作：從低溫冰柜中拿出菌種凍存管，室溫下擱置使其自然解凍。將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培育基等移入工作臺。用75%酒精棉球擦抹菌種凍存管外壁，稍干。點燃酒精燈，在火焰旁翻開菌種凍存管蓋，用一支滅菌滴管汲取解凍的菌懸液，接種至10ml液體培育基中（生孢梭菌需接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培育基中）?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培育基上。將用過的滴管和菌種管投入消毒液內浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。將上述接種后的培育基在規(guī)定溫度下培育（細菌在30~35℃恒溫培育18-24小時，真菌在23~28℃恒溫培育24-48小時，黑曲霉培育5~7天）。認真察看培育物：如呈典型菌落即可作為平時工作中使用的菌種，注明菌名、編號、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內保留；如發(fā)現菌苔形狀不典型，可進行平板分別單菌落。注意：已解凍的凍存管不行再凍存。菌種的接種、傳代.準備①器具：接種環(huán)、酒精燈。②培育基：營養(yǎng)瓊脂或改進馬丁瓊脂斜面培育基或適合的液體培育基。培育基應新鮮制備，如斜面已干縮，無冷凝水，則不宜再使用。③消毒液：75%酒精、%新潔爾滅或84消毒液。④菌種：依據2010年版《中國藥典》的要求，傳代次數（n）應不超過4代。將冰箱中拿出的菌種斜面，在室溫擱置入接種室內或超凈工作臺。

30分鐘，待溫度均衡后再移點燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊湊近火焰旁。用右手在火焰旁轉動兩管的棉塞，以便接種時易拔取，再以右手持接種環(huán)在火焰上燒紅30秒鐘，隨后將所有鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，來回經過3次。右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，左手將管口在火焰上旋轉炙烤，右手再輕輕拔出棉塞，夾在無名指、小指及掌部，并勿使其與任何物件接觸。將灼燒過的接種環(huán)插入菌種管內，先接觸無菌苔生長的培育基上，待冷后，從斜面上挑取菌苔少量，拿出時，接種環(huán)不可以經過分焰，應在火焰旁快速插入至接種管內液體培育基中，或在瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面波折挪動，使細菌劃在斜面的表面上，注意只劃動一次，勿重復挪動，且勿使菌苔沾在管壁口。拿出接種環(huán)，立刻將管口經過分焰滅菌，右手到火焰旁將試管棉塞塞上，而后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。已接種畢的各管貼好標簽，注明菌名、編號、代次（n+1）和接種日期，細菌管置30~35℃培育18~24小時；真菌管一般置23~28℃培育24~48小時（黑曲霉需培育5~7天）。培育到期后拿出培育物，認真察看菌苔形態(tài)，能否正常，并與上代菌種比較，有無雜菌。必需時涂片，革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落即可作為平時工作中使用的菌種。如發(fā)現菌苔形狀不典型，可持續(xù)進行平板劃線培育，分別單菌落，精選典型菌苔接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，取代原有的工作用菌種。檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內2~8℃保留，一般1個月轉種一次。菌種（第n代）接種至適合培育基中，在規(guī)定的溫度條件下的培育物，即為第n+1代。注意：黑曲霉*致病性很強，操作時應特別注意：①黑曲霉孢子相當穩(wěn)固，其在%氯化鈉溶液中，4℃左右的條件下能夠保留較長的時間，故可將此孢子懸液作為貯備液在1~2月內使用，以減少頻頻操作的風險性。②為防備黑曲霉孢子的流傳，接種傳代時應封閉風機，近酒精燈操作。③若傳代的母代菌種為菌懸液，則用無菌吸管吹吸管內液體，取1～2滴滴在改進馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布平均，置23～28℃培育5～日。④接種傳代時，改進馬丁斜面一定是干燥的，不然影響其孢子的形成。⑤接種傳代后，使用過的器具均需在121℃，30分鐘高壓滅菌后再作辦理。菌種的保留：菌懸液凍存法：凍干菌種（0代）復蘇后，可按上述方法制備第1代菌懸液、第2代菌懸液進行凍存。瓊脂斜面低溫保留法：平時使用的工作用菌種可用此法在短期內保存。將常常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特別菌種可用液體培育基）上，按規(guī)定的溫度和時間培育，待充分生長后，把培育好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培育基的水分蒸發(fā)，延伸收藏時間，可將菌種收藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中收藏。每隔1個月移種一次，持續(xù)進行收藏。合用范圍：細菌、酵母菌、真菌收藏。各種菌種收藏條件實時間：菌種培育基保留溫傳種時間度一般多用營養(yǎng)瓊脂或依據菌種芽孢桿菌3~6個細菌4~6℃月規(guī)定采用培育基其余細菌每個月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵4~6℃一般4~6個月母膏瓊脂每4個月移植一絲狀真一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥4~6℃次菌芽汁瓊脂等。（每2個月移植一次）注意事項：①收藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培育物，起碼應是第三代的培育物。②收藏時，破傷風桿菌可用庖肉培育基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培育基。③一定按期檢查收藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞能否松動或生霉，若有異樣應實時辦理。④每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐個查對，確證培育基特點和純度無誤后再持續(xù)收藏。⑤銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，應在室溫下保留。液體白臘保留法：利用白臘將培育物與空氣隔斷，以降低菌種的生理生化水平，并可防備水分蒸發(fā)，進而延伸菌種的收藏期。方法：將菌種接種于斜面或穿刺于~%瓊脂半固體高層培育基中，培育好備用。取化學純的液體白臘裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，拿出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內除掉液體白臘中的水分。將上述液體白臘加入培育好的菌種試管內，液體白臘液面以超出培育基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中收藏。合用范圍：合用于收藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏成效較差。注意事項：①收藏時，用新鮮培育物接種，應檢查純度和特點后，方可進行收藏。②收藏過程中，需常常察看斜面能否干燥，如干燥，需從頭移種。③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體白臘流至一邊，再用接種針挑取培育物接種到新鮮斜面上培育，待長出新培育物后，再移種一次到新斜面上即可使用。④將沾有少量液體白臘的接種針浸于95%酒精中片晌，再炙烤滅菌，免得直接在酒精燈下炙烤時，液體白臘四濺，惹起污染。⑤液體白臘在菌種管中超出培育基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種互換氣體，使收藏成效不好；如太少，斜面簡單干燥，將縮短收藏期。一般以超出斜面1㎝為宜。⑥制備無菌液體白臘時，每管裝量不可以太多，不然分裝到菌種培育基中易造成污染。菌種在傳代、保留或使用過程中發(fā)現污染、變異，應實時銷毀，不得用于慣例查驗。菌種傳代、保留及使用、銷毀均應填寫相應記錄：《0代菌種保留使用記錄》、《凍存菌種保留使用記錄》、《菌種傳代記錄》、《菌種使用記錄》及《菌種銷毀記錄》。菌種按“檢定菌管理制度”管理。附錄：菌種編號：傳代復蘇的菌種應有一致編號,編號方法為:菌種代號-G或W-代次-管號。G表示用于凍存的菌種，W表示工作用菌種。25～30℃。在-□□□□-□-□（□）注：①②③④⑤①菌種代號：常用菌種的代號見下表：菌種名稱代號菌種名稱代號菌種名稱代號金黃色葡萄球JP生孢梭菌SB大腸埃希菌DC菌銅綠假單孢桿TL白色念珠BN短小芽孢桿菌DX菌菌枯草芽孢桿菌KC黑曲霉HQ藤黃微球菌TH②菌種購進的年、月：如0608表示2006年8月購進③菌種代次，用1、2、3、4、5表示。④母代凍存菌種的編號，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。⑤菌種的序號，用1、2、3表示。常用工作用菌種的生物學特點①金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色：圓球形擺列成典型的葡萄狀，菌落直徑為～，革蘭氏染色陽性。培育特征：⑴在肉湯瓊脂培育基、營養(yǎng)肉湯中，生長優(yōu)秀。在28～38℃生長較好，pH為～，以左右最好。⑵營養(yǎng)瓊脂平板，培育24～48小時，形成圓形凸出、邊沿齊整、表面光彩且金黃色的菌落，直徑1～2mm（應精選圓滑型菌落）。⑶營養(yǎng)肉湯培育基，生長快速，經37℃24小時培育呈平均渾濁，管底稍有積淀，輕輕振搖即可上漲，消失平均。但培育基含有可發(fā)酵糖類或菌型變成粗拙型者，可出現自然凝聚現象，⑷抵擋力：在干燥狀況下，可生計數月，在無糖培育基內生計數年。對熱80℃30分鐘才被殺死。在1%石炭酸液中15分鐘被殺死，碘酒中須1分鐘，75%酒精中須數十分鐘才被殺死。②藤黃微球菌形態(tài)與染色：個體略大于葡萄球菌，直徑～，單個成雙或四聯狀擺列，或呈不規(guī)則的團塊。革蘭氏染色呈陽性。培育特征：專性需氧菌，營養(yǎng)要求不高，最適溫度為瓊脂平板上培育可形成圓形突出，圓滑、不透明黃色菌落。在液體培育基中均為渾濁生長。③枯草桿菌形態(tài)與染色：菌體細短棒狀，～寬，～長，單個或呈鏈狀，兩頭半圓形，染色平均。芽孢～寬，～長，橢圓形或圓柱形，常產生于菌體中央或湊近中央。革蘭氏染色呈陽性，能運動。培育特征：⑴營養(yǎng)瓊脂平板：菌落表面粗拙，圓形，凹凸不平，邊沿鋸齒狀，稍有延伸，呈白色或微黃色，應精選粗拙形菌落），本菌變異時可出現圓滑型菌落。⑵營養(yǎng)肉湯培育基中呈少量渾濁并生積淀，在液體表面形成皺狀厚膜，粘附于試管壁上。⑶培育最適溫度30～37℃，生長范圍15～55℃，兼性厭氧或需氧。⑷抵擋力：菌體濕熱55℃，1小時即被殺死，芽孢能耐高溫，100℃3小時才被殺死，120℃40分鐘才被殺死。④短小芽孢桿菌形態(tài)與染色：本菌為桿狀，革蘭氏染色陽性，無莢膜，芽孢偏生，橢圓形，有動力。培育特征：本菌與枯草桿菌相像，培育最適溫度30～37℃，生長范圍15～50℃，兼性厭氧或需氧。別的，短小芽孢桿菌有兩點不一樣于枯草桿菌：在瓊脂培育基上，大部分菌株的菌落為圓滑型并變成微黃色，用于檢定的菌種，應挑圓滑型菌落；有些菌株營養(yǎng)需要生物素（維生素H）及氨基酸。⑤大腸埃希菌形態(tài)與染色：短桿菌～寬，2～4um長，兩頭鈍圓，大部分有5～8根鞭毛，運動活波，但亦有無鞭毛，不運動，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性。培育特征：菌落扁平，圓滑，圓潤，在EMB瓊脂平板上呈紫黑色，有金屬光彩。⑥白色念珠菌形態(tài)與染色：本菌為革蘭氏陽性，但染色不平均，卵圓形，壁薄生芽的酵母樣菌。大小為～4um。培育特征：瓊脂平板培育，菌落表面潤濕黏稠，圓形，乳白色，微凸，邊沿齊整。⑦生孢梭菌形態(tài)與染色：大部分菌株周身皆有鞭毛，能運動，并可形成桿狀或梭狀芽孢桿菌，菌體一般較粗大，長約3～8um，寬約～。革蘭氏染色呈陽性，菌體老化后?？勺兂申幮?。培育特征：本菌嚴格厭氧，培育的最適溫度為37℃。在瓊脂平板上培育24～48小時，生長遲緩，菌落直徑2～5mm，延伸生長，邊沿不規(guī)則，有鋸齒狀崛起；在硫乙醇酸鹽流體