菌種的復(fù)蘇傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序

菌種的復(fù)蘇傳代及保留標(biāo)準(zhǔn)程序目的：成立菌種的復(fù)蘇、傳代及保留標(biāo)準(zhǔn)程序。范圍：合用于檢定用菌種的復(fù)蘇、傳代及保留的操作。職責(zé)：質(zhì)管部生物測(cè)定人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)行負(fù)責(zé)。內(nèi)容：菌種的復(fù)蘇與傳代操作均應(yīng)在生物檢定室陽(yáng)性比較間或?qū)Ｓ贸瑑艄ぷ髋_(tái)內(nèi)進(jìn)行。操作中使用過(guò)的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)121℃30分鐘高溫滅菌辦理。菌種的復(fù)蘇凍干菌種的復(fù)蘇檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國(guó)藥品生物制品檢定所供給，為冷凍干燥菌種(0代)。使用前需將其復(fù)蘇。準(zhǔn)備：①器具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。②培育基：依據(jù)菌種的性質(zhì)選擇適合的液體培育基（營(yíng)養(yǎng)肉湯培育基或改進(jìn)馬丁培育基）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（或改進(jìn)馬丁瓊脂）斜面數(shù)支。③消毒液：75%酒精、碘酒、%新潔爾滅或84消毒液等。操作：將準(zhǔn)備妥的冷凍菌種管、滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、培育基移入工作臺(tái)。用砂輪將凍干菌種管頸部挫出刻痕，再75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內(nèi)待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱，用滅菌滴管汲取液體培育基少量，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口翻開后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內(nèi)。另取一支滅菌滴管，在火焰旁汲取合用液體培育基少量，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促進(jìn)溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至液體培育基內(nèi)。用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培育基上。將已接種的液體培育基及瓊脂斜面培育基置規(guī)定溫度下（一般細(xì)菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培育24h。拿出培育物（第1代），認(rèn)真察看菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌，必需時(shí)涂片、革蘭氏染色鏡檢，若呈典型菌落即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分別單菌落。為保證工作用菌株的傳代次數(shù)不超出5代，并減少購(gòu)置凍干菌種的次數(shù)，可在對(duì)凍干菌種復(fù)蘇的同時(shí)制備部分菌懸液（第1代）冷凍保存，并將此凍存菌液復(fù)蘇后的第2代培育物凍存收藏。準(zhǔn)備：①凍存保護(hù)液（40%無(wú)菌甘油）及滅菌凍存管。②細(xì)菌凍存液：由液體培育基與凍存保護(hù)液按1：1比例混勻制成。按操作，將凍干菌復(fù)溶后，汲取菌懸液加入到細(xì)菌凍存液中，混勻。按1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。注明菌名、編號(hào)及凍存日期等。置-20℃或-80℃條件下冷凍保留。制備第2代凍存菌懸液時(shí)，可用接種環(huán)直接刮取第1代凍存菌懸液復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種至瓊脂斜面或平板培育基上生長(zhǎng)的純菌落，再接種至細(xì)菌凍存液中，混勻后按凍存。凍存菌懸液的復(fù)蘇：準(zhǔn)備：①器具：滅菌1ml滴管、酒精燈、接種環(huán)。②培育基：依據(jù)菌種的特征選擇適合的液體培育基（如營(yíng)養(yǎng)肉湯培育基10ml、硫乙醇酸鹽流體培育基12ml或改進(jìn)馬丁培育基10ml等）、瓊脂斜面或平板培育基。③消毒液：75%酒精、%新潔爾滅或84消毒液等。操作：從低溫冰柜中拿出菌種凍存管，室溫下擱置使其自然解凍。將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培育基等移入工作臺(tái)。用75%酒精棉球擦抹菌種凍存管外壁，稍干。點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁翻開菌種凍存管蓋，用一支滅菌滴管汲取解凍的菌懸液，接種至10ml液體培育基中（生孢梭菌需接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培育基中）?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培育基上。將用過(guò)的滴管和菌種管投入消毒液內(nèi)浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。將上述接種后的培育基在規(guī)定溫度下培育（細(xì)菌在30~35℃恒溫培育18-24小時(shí)，真菌在23~28℃恒溫培育24-48小時(shí)，黑曲霉培育5~7天）。認(rèn)真察看培育物：如呈典型菌落即可作為平時(shí)工作中使用的菌種，注明菌名、編號(hào)、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內(nèi)保留；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可進(jìn)行平板分別單菌落。注意：已解凍的凍存管不行再凍存。菌種的接種、傳代.準(zhǔn)備①器具：接種環(huán)、酒精燈。②培育基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂或改進(jìn)馬丁瓊脂斜面培育基或適合的液體培育基。培育基應(yīng)新鮮制備，如斜面已干縮，無(wú)冷凝水，則不宜再使用。③消毒液：75%酒精、%新潔爾滅或84消毒液。④菌種：依據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》的要求，傳代次數(shù)（n）應(yīng)不超過(guò)4代。將冰箱中拿出的菌種斜面，在室溫?cái)R置入接種室內(nèi)或超凈工作臺(tái)。

30分鐘，待溫度均衡后再移點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊湊近火焰旁。用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管的棉塞，以便接種時(shí)易拔取，再以右手持接種環(huán)在火焰上燒紅30秒鐘，隨后將所有鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，來(lái)回經(jīng)過(guò)3次。右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住棉塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)炙烤，右手再輕輕拔出棉塞，夾在無(wú)名指、小指及掌部，并勿使其與任何物件接觸。將灼燒過(guò)的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培育基上，待冷后，從斜面上挑取菌苔少量，拿出時(shí)，接種環(huán)不可以經(jīng)過(guò)分焰，應(yīng)在火焰旁快速插入至接種管內(nèi)液體培育基中，或在瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面波折挪動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上，注意只劃動(dòng)一次，勿重復(fù)挪動(dòng)，且勿使菌苔沾在管壁口。拿出接種環(huán)，立刻將管口經(jīng)過(guò)分焰滅菌，右手到火焰旁將試管棉塞塞上，而后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。已接種畢的各管貼好標(biāo)簽，注明菌名、編號(hào)、代次（n+1）和接種日期，細(xì)菌管置30~35℃培育18~24小時(shí)；真菌管一般置23~28℃培育24~48小時(shí)（黑曲霉需培育5~7天）。培育到期后拿出培育物，認(rèn)真察看菌苔形態(tài)，能否正常，并與上代菌種比較，有無(wú)雜菌。必需時(shí)涂片，革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落即可作為平時(shí)工作中使用的菌種。如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可持續(xù)進(jìn)行平板劃線培育，分別單菌落，精選典型菌苔接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，取代原有的工作用菌種。檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內(nèi)2~8℃保留，一般1個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。菌種（第n代）接種至適合培育基中，在規(guī)定的溫度條件下的培育物，即為第n+1代。注意：黑曲霉*致病性很強(qiáng)，操作時(shí)應(yīng)特別注意：①黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)固，其在%氯化鈉溶液中，4℃左右的條件下能夠保留較長(zhǎng)的時(shí)間，故可將此孢子懸液作為貯備液在1~2月內(nèi)使用，以減少頻頻操作的風(fēng)險(xiǎn)性。②為防備黑曲霉孢子的流傳，接種傳代時(shí)應(yīng)封閉風(fēng)機(jī)，近酒精燈操作。③若傳代的母代菌種為菌懸液，則用無(wú)菌吸管吹吸管內(nèi)液體，取1～2滴滴在改進(jìn)馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布平均，置23～28℃培育5～日。④接種傳代時(shí)，改進(jìn)馬丁斜面一定是干燥的，不然影響其孢子的形成。⑤接種傳代后，使用過(guò)的器具均需在121℃，30分鐘高壓滅菌后再作辦理。菌種的保留：菌懸液凍存法：凍干菌種（0代）復(fù)蘇后，可按上述方法制備第1代菌懸液、第2代菌懸液進(jìn)行凍存。瓊脂斜面低溫保留法：平時(shí)使用的工作用菌種可用此法在短期內(nèi)保存。將常常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特別菌種可用液體培育基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培育，待充分生長(zhǎng)后，把培育好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培育基的水分蒸發(fā)，延伸收藏時(shí)間，可將菌種收藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中收藏。每隔1個(gè)月移種一次，持續(xù)進(jìn)行收藏。合用范圍：細(xì)菌、酵母菌、真菌收藏。各種菌種收藏條件實(shí)時(shí)間：菌種培育基保留溫傳種時(shí)間度一般多用營(yíng)養(yǎng)瓊脂或依據(jù)菌種芽孢桿菌3~6個(gè)細(xì)菌4~6℃月規(guī)定采用培育基其余細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵4~6℃一般4~6個(gè)月母膏瓊脂每4個(gè)月移植一絲狀真一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥4~6℃次菌芽汁瓊脂等。（每2個(gè)月移植一次）注意事項(xiàng)：①收藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培育物，起碼應(yīng)是第三代的培育物。②收藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培育基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培育基。③一定按期檢查收藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞能否松動(dòng)或生霉，若有異樣應(yīng)實(shí)時(shí)辦理。④每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐個(gè)查對(duì)，確證培育基特點(diǎn)和純度無(wú)誤后再持續(xù)收藏。⑤銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，應(yīng)在室溫下保留。液體白臘保留法：利用白臘將培育物與空氣隔斷，以降低菌種的生理生化水平，并可防備水分蒸發(fā)，進(jìn)而延伸菌種的收藏期。方法：將菌種接種于斜面或穿刺于~%瓊脂半固體高層培育基中，培育好備用。取化學(xué)純的液體白臘裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，拿出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除掉液體白臘中的水分。將上述液體白臘加入培育好的菌種試管內(nèi)，液體白臘液面以超出培育基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中收藏。合用范圍：合用于收藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏成效較差。注意事項(xiàng)：①收藏時(shí)，用新鮮培育物接種，應(yīng)檢查純度和特點(diǎn)后，方可進(jìn)行收藏。②收藏過(guò)程中，需常常察看斜面能否干燥，如干燥，需從頭移種。③使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體白臘流至一邊，再用接種針挑取培育物接種到新鮮斜面上培育，待長(zhǎng)出新培育物后，再移種一次到新斜面上即可使用。④將沾有少量液體白臘的接種針浸于95%酒精中片晌，再炙烤滅菌，免得直接在酒精燈下炙烤時(shí)，液體白臘四濺，惹起污染。⑤液體白臘在菌種管中超出培育基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種互換氣體，使收藏成效不好；如太少，斜面簡(jiǎn)單干燥，將縮短收藏期。一般以超出斜面1㎝為宜。⑥制備無(wú)菌液體白臘時(shí)，每管裝量不可以太多，不然分裝到菌種培育基中易造成污染。菌種在傳代、保留或使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)污染、變異，應(yīng)實(shí)時(shí)銷毀，不得用于慣例查驗(yàn)。菌種傳代、保留及使用、銷毀均應(yīng)填寫相應(yīng)記錄：《0代菌種保留使用記錄》、《凍存菌種保留使用記錄》、《菌種傳代記錄》、《菌種使用記錄》及《菌種銷毀記錄》。菌種按“檢定菌管理制度”管理。附錄：菌種編號(hào)：傳代復(fù)蘇的菌種應(yīng)有一致編號(hào),編號(hào)方法為:菌種代號(hào)-G或W-代次-管號(hào)。G表示用于凍存的菌種，W表示工作用菌種。25～30℃。在-□□□□-□-□（□）注：①②③④⑤①菌種代號(hào)：常用菌種的代號(hào)見下表：菌種名稱代號(hào)菌種名稱代號(hào)菌種名稱代號(hào)金黃色葡萄球JP生孢梭菌SB大腸埃希菌DC菌銅綠假單孢桿TL白色念珠BN短小芽孢桿菌DX菌菌枯草芽孢桿菌KC黑曲霉HQ藤黃微球菌TH②菌種購(gòu)進(jìn)的年、月：如0608表示2006年8月購(gòu)進(jìn)③菌種代次，用1、2、3、4、5表示。④母代凍存菌種的編號(hào)，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。⑤菌種的序號(hào)，用1、2、3表示。常用工作用菌種的生物學(xué)特點(diǎn)①金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色：圓球形擺列成典型的葡萄狀，菌落直徑為～，革蘭氏染色陽(yáng)性。培育特征：⑴在肉湯瓊脂培育基、營(yíng)養(yǎng)肉湯中，生長(zhǎng)優(yōu)秀。在28～38℃生長(zhǎng)較好，pH為～，以左右最好。⑵營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，培育24～48小時(shí)，形成圓形凸出、邊沿齊整、表面光彩且金黃色的菌落，直徑1～2mm（應(yīng)精選圓滑型菌落）。⑶營(yíng)養(yǎng)肉湯培育基，生長(zhǎng)快速，經(jīng)37℃24小時(shí)培育呈平均渾濁，管底稍有積淀，輕輕振搖即可上漲，消失平均。但培育基含有可發(fā)酵糖類或菌型變成粗拙型者，可出現(xiàn)自然凝聚現(xiàn)象，⑷抵擋力：在干燥狀況下，可生計(jì)數(shù)月，在無(wú)糖培育基內(nèi)生計(jì)數(shù)年。對(duì)熱80℃30分鐘才被殺死。在1%石炭酸液中15分鐘被殺死，碘酒中須1分鐘，75%酒精中須數(shù)十分鐘才被殺死。②藤黃微球菌形態(tài)與染色：個(gè)體略大于葡萄球菌，直徑～，單個(gè)成雙或四聯(lián)狀擺列，或呈不規(guī)則的團(tuán)塊。革蘭氏染色呈陽(yáng)性。培育特征：專性需氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，最適溫度為瓊脂平板上培育可形成圓形突出，圓滑、不透明黃色菌落。在液體培育基中均為渾濁生長(zhǎng)。③枯草桿菌形態(tài)與染色：菌體細(xì)短棒狀，～寬，～長(zhǎng)，單個(gè)或呈鏈狀，兩頭半圓形，染色平均。芽孢～寬，～長(zhǎng)，橢圓形或圓柱形，常產(chǎn)生于菌體中央或湊近中央。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，能運(yùn)動(dòng)。培育特征：⑴營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板：菌落表面粗拙，圓形，凹凸不平，邊沿鋸齒狀，稍有延伸，呈白色或微黃色，應(yīng)精選粗拙形菌落），本菌變異時(shí)可出現(xiàn)圓滑型菌落。⑵營(yíng)養(yǎng)肉湯培育基中呈少量渾濁并生積淀，在液體表面形成皺狀厚膜，粘附于試管壁上。⑶培育最適溫度30～37℃，生長(zhǎng)范圍15～55℃，兼性厭氧或需氧。⑷抵擋力：菌體濕熱55℃，1小時(shí)即被殺死，芽孢能耐高溫，100℃3小時(shí)才被殺死，120℃40分鐘才被殺死。④短小芽孢桿菌形態(tài)與染色：本菌為桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)莢膜，芽孢偏生，橢圓形，有動(dòng)力。培育特征：本菌與枯草桿菌相像，培育最適溫度30～37℃，生長(zhǎng)范圍15～50℃，兼性厭氧或需氧。別的，短小芽孢桿菌有兩點(diǎn)不一樣于枯草桿菌：在瓊脂培育基上，大部分菌株的菌落為圓滑型并變成微黃色，用于檢定的菌種，應(yīng)挑圓滑型菌落；有些菌株?duì)I養(yǎng)需要生物素（維生素H）及氨基酸。⑤大腸埃希菌形態(tài)與染色：短桿菌～寬，2～4um長(zhǎng)，兩頭鈍圓，大部分有5～8根鞭毛，運(yùn)動(dòng)活波，但亦有無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性。培育特征：菌落扁平，圓滑，圓潤(rùn)，在EMB瓊脂平板上呈紫黑色，有金屬光彩。⑥白色念珠菌形態(tài)與染色：本菌為革蘭氏陽(yáng)性，但染色不平均，卵圓形，壁薄生芽的酵母樣菌。大小為～4um。培育特征：瓊脂平板培育，菌落表面潤(rùn)濕黏稠，圓形，乳白色，微凸，邊沿齊整。⑦生孢梭菌形態(tài)與染色：大部分菌株周身皆有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，并可形成桿狀或梭狀芽孢桿菌，菌體一般較粗大，長(zhǎng)約3～8um，寬約～。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體老化后?？勺兂申幮?。培育特征：本菌嚴(yán)格厭氧，培育的最適溫度為37℃。在瓊脂平板上培育24～48小時(shí)，生長(zhǎng)遲緩，菌落直徑2～5mm，延伸生長(zhǎng)，邊沿不規(guī)則，有鋸齒狀崛起；在硫乙醇酸鹽流體