高效液相色譜分析環(huán)境

高效液相色譜分析環(huán)境2023/7/21第1頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1高效液相色譜法（HPLC）特點

高效液相色譜是一種以高壓輸出的液體為流動相的色譜技術(shù)，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器。同氣相色譜法（GC）相比，高效液相色譜法（HPLC）具有以下特點：GC只能分析氣體和沸點較低的化合物；對于那些沸點高、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的有機物，目前主要采用HPLC進行分析。GC的流動相是惰性氣體，僅起運載作用；HPLC的流動相可選擇不同極性的液體，對組分有一定的親和力，可通過改變固定相和流動相提高HPLC的分離效率。GC一般在較高溫度下進行分離和測定，其應(yīng)用范圍收到了很大的限制；HPLC一般在室溫下進行分析，不受樣品揮發(fā)性和高溫下穩(wěn)定性的限制注意：GC更快、更靈敏、更方便，而且耗費低，因此能用GC分析的樣品一般不用HPLC。第2頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀是由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、和檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)等五個主要部分構(gòu)成，此外還配有輔助裝置，如脫氣機、梯度洗脫、自動進樣等。其結(jié)構(gòu)示意圖如下：第3頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)和工作流程工作流程：高壓泵將貯液瓶中的溶劑送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，當待測樣品從注射器注入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，然后依次進入檢測器，由記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來得到色譜圖。第4頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月一、高壓輸液系統(tǒng)由于HPLC所用的固定相顆粒極細，因此對流動相的阻力很大，為使流動相有較大的流速，必須配備高壓輸液系統(tǒng)。高壓輸液系統(tǒng)一般由貯液器、高壓泵、脫氣機、梯度洗脫等裝置組成。第5頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1、溶劑脫氣裝置（脫氣機）脫氣裝置的作用目的是：為了防止流動相從高壓柱流出時，釋放出的氣泡（溶解在溶劑中的N2、O2等）進入檢測器而使噪聲劇增，甚至不能檢測。溶劑脫氣方式有氦氣鼓泡、超聲波脫氣、真空脫氣等。2、高壓泵高壓泵的作用：保證輸出的流動相具有恒定的流速。高壓泵輸出流動相的壓力，一般為150×105～350×105Pa，高壓泵應(yīng)無脈動或脈動極小。第6頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、梯度洗脫梯度洗脫：流動相中含有兩種或更多不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，通過流動相中極性的變化來改變被分離組分的容量因子k和選擇性因子a，以提高分離效果。為什么要進行梯度洗脫？在進行多組分的復(fù)雜樣品分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰時間很晚、峰形較差。為使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達到分離且有良好的峰形，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。其作用相當于氣相色譜中的程序升溫。第7頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)溶劑的混合方式，可分為低壓梯度和高壓梯度。低壓梯度：在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┯帽壤y混合后再用泵輸入色譜柱，也稱為外梯度。優(yōu)點：只需要一個單元泵，成本低，使用方便。高壓梯度：將溶劑分別用高壓泵增壓后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱，又稱為內(nèi)梯度。優(yōu)點：通過梯度程序控制器控制每臺單元泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度高。缺點：需要兩臺或多臺泵，成本高。第8頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月進樣口檢測器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器二元泵高壓洗脫系統(tǒng)第10頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月由一個單元泵和比例閥組成的四元梯度洗脫系統(tǒng)2023/7/21第11頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月二、進樣系統(tǒng)柱外展寬：指色譜柱外的因素引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在的死體積引起的峰展寬。柱外展寬可分為柱前展寬和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此對進樣系統(tǒng)要求比較嚴格。進樣要求：將試樣“濃縮”地瞬時注入色譜柱上端柱擔(dān)體的中心成一個小點。如果注入柱擔(dān)體前的流動相中，通常會使溶質(zhì)以擴散形式進入柱頂，會導(dǎo)致試樣組分分離效能的降低進樣裝置一般有隔膜注射器進樣、停流進樣、高壓定量進樣閥和自動進樣器進樣。2023/7/21第12頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1、隔膜注射器進樣與氣相色譜類似。在色譜柱頂端裝一耐壓彈性隔膜，進樣時用微量注射器刺穿隔膜將樣品注入色譜柱。優(yōu)點：裝置簡單、價廉、死體積?。蝗秉c：允許進樣量小，重現(xiàn)性差；不能承受高壓，當壓力超過150×105Pa后，由于密封墊的泄漏，帶壓進樣實際上成為不可能。2023/7/21第13頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、停流進樣方法：打開流動相泄流閥，使柱前壓力下降為零，注射器進樣（同隔膜注射器進樣法）后，關(guān)閉閥門使流動相壓力恢復(fù)，把試樣帶入色譜柱。優(yōu)點：停流后再進樣，以防止泄漏，可用于高壓。缺點：停流進樣方式無法取得精確的保留時間，峰形的重現(xiàn)性亦較差。2023/7/21第14頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、高壓定量進樣閥（六通閥進樣）六通閥進樣是目前最常用的手動進樣方式。2023/7/21第15頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月特點：注射器要取比定量管容積大3~5倍的試樣溶液，多余的試樣通過連接6的管道溢出。由于進樣可由定量管的體積嚴格控制，因此進樣準確，重復(fù)性好，適用于定量分析，更換不同體積的定量管，可調(diào)整進樣量。也可采用較大體積的進樣管進少量試樣，進樣量由注射器控制。注意：六通閥的內(nèi)部管道很細，樣品液中絕不應(yīng)帶有固體微粒，以免堵塞通道；另外，樣品液的濃度也不宜太高，以防止其在進樣閥內(nèi)結(jié)晶析出。應(yīng)經(jīng)常清洗進樣閥的通道：閥的扳手放在進樣位置，使沖洗液從廢液口5流出。2023/7/21第16頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、自動進樣器進樣由計算機自動控制定量閥，按預(yù)先編制好的程序進樣，可自動完成幾十或上百個樣品的分析。在進行大量樣品的分析時，使用自動進樣器操作可節(jié)省大量的人力和時間，但此裝置成本高。2023/7/21第17頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分離系統(tǒng)——色譜柱色譜柱包括柱管和固定相兩部分。常用的標準柱型是內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長度為15~30cm的直型不銹鋼柱，填料顆粒度5~10mm。一個重要的發(fā)展趨勢是減小填料顆粒度（3~5mm），以采用更短的柱（數(shù)厘米），加快分析速度。2023/7/21第18頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜柱的分離效能，主要取決于柱填料的性能和柱床的結(jié)構(gòu)（柱子的裝填）柱子的裝填對柱效能影響很大，裝柱方法有干法和濕法兩種。干法：填料粒度大于20mm（和氣相色譜法裝料方法相同）濕法（勻漿法）：通常采用勻漿法填充HPLC色譜柱，先將填料配成懸浮液，在高壓泵的作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。2023/7/21第19頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：色譜柱裝填料之前是沒有方向的，但裝填好固定相后柱子是有方向的。使用時，應(yīng)使流動相的方向與柱子的填充方向一致。通常在柱子的管外用箭頭標示出流動相方向，安裝色譜柱時應(yīng)注意。2023/7/21第20頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月四、檢測系統(tǒng)液相色譜檢測器有紫外光度檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器。應(yīng)用最廣泛的液相色譜檢測器是紫外檢測器和示差折光檢測器。注意：液相色譜中，沒有一個即通用，還可用于梯度洗脫的檢測器。2023/7/21第21頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1、紫外光度檢測器HPLC中應(yīng)用最廣泛的一種檢測器，有70%的樣品可以使用這種檢測器。原理：基于被分析試樣組分對特定波長紫外線的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。優(yōu)點：靈敏度高，最小檢測濃度可達10-9g·mL-1，對溫度、流速不敏感、可用于梯度洗脫缺點：不適用于對紫外光完全不吸收的試樣，溶劑的選用受限制（紫外光不透過的溶劑如苯等不能用）2023/7/21第22頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、熒光檢測器原理：熒光檢測器是利用某些樣品具有熒光特性來檢測的。許多有機化合物具有天然熒光活性，其中帶有芳香基團的化合物具有熒光活性很強。在一定條件下，熒光強度與物質(zhì)濃度成正比。特性：選擇性強（適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定）、對溫度、流速不敏感，可用于梯度洗脫。優(yōu)點：靈敏度高，檢出限可達10-12~10-13g/mL，比紫外檢測器高2~3個數(shù)量級。缺點：僅適用于發(fā)熒光的物質(zhì)。2023/7/21第23頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、示差折光檢測器借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度。原理：溶液的折射率是純?nèi)軇鲃酉啵┖图內(nèi)苜|(zhì)（試樣）的折射率乘以各物質(zhì)的濃度之和。因此溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差，可表示試樣在流動相中的濃度。優(yōu)點：幾乎各種物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此都可用示差折光檢測器檢測，是通用型的濃度型檢測器。缺點：對溫度變化敏感，不可用于梯度洗脫。2023/7/21第24頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、電導(dǎo)檢測器原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中解離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測定解離物質(zhì)含量。電導(dǎo)檢測器屬電化學(xué)檢測器，是離子色譜法中使用最廣泛的檢測器。5、蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器是基于不揮發(fā)性溶質(zhì)對光的散射現(xiàn)象，是一種通用性較強的檢測器。2023/7/21第25頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月特點：與示差折光檢測器相比，具有靈敏度高，響應(yīng)信號不受溶劑和溫度的影響，可用于梯度洗脫。但不宜采用非揮發(fā)性緩沖溶液為流動相。應(yīng)用：廣泛用于檢測糖類、表面活性劑、聚合物、酯類等無紫外吸收或紫外吸收系數(shù)較小的物質(zhì)。此外，蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與試樣質(zhì)量成正比，即對所有樣品的響應(yīng)因子接近一致，因此可以在沒有標準品的情況下，采用內(nèi)標法測定未知物的近似含量。。2023/7/21第26頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章

高效液相色譜分析3.3高效液相色譜法的主要類型及其分離原理2023/7/21第27頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1、液液分配色譜法及化學(xué)鍵合液相色譜概述：固定相和流動相均為液體（互不相溶）基本原理：組分在固定相和流動相上的分配（同氣相色譜）分配系數(shù)液液分配色譜與氣液分配色譜相似之處分離的順序取決于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保留值大，出峰晚

液液分配色譜與氣液分配色譜不同之處氣相色譜中流動相的性質(zhì)對分配系數(shù)影響不大，而液相色譜法中流動相的種類對分配系數(shù)卻有較大的影響2023/7/21第28頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月在液液色譜中，為防止固定液的流失，一般親水性固定液采用疏水性流動相，疏水性固定液采用親水性流動相。正相色譜法：固定相的極性大于流動性的極性，樣品中極性小的組分先流出，極性大的組分后流出反相色譜法：固定相的極性小于流動性的極性，樣品中極性大的組分先流出，極性小的組分后流出化學(xué)鍵合固定相：為了更好的解決固定液從載體上流失的問題，將各種不同的有機基團通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵健合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，代替機械涂漬的液體固定相，從而產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相，是目前液相色譜法應(yīng)用最廣泛的一個分支。2023/7/21第29頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、液固色譜法概述：流動相為液體，固定相為吸附劑?；驹恚浩渥饔脵C制是溶質(zhì)分子（X）和溶劑分子（S）對吸附劑活性表面的競爭吸附。常用的固體吸附劑，如硅膠，氧化鋁等。較常用的是5~10mm的硅膠吸附劑。適用：分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。缺點：非線性等溫吸附引起峰的拖尾現(xiàn)象。2023/7/21第30頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、離子對色譜法各種強極性的有機酸、有機堿的分離分析是液相色譜法中的重要課題，用吸附或分配色譜一般需要強極性的洗脫液，并容易發(fā)生嚴重的拖尾現(xiàn)象，利用離子交換色譜需要選擇合適的pH條件，此外以高分子材料為基體的樹脂填料一般不能承受高壓，傳質(zhì)性能也較差。若用離子對色譜法，則分離效能高，分析速度快，操作簡便。2023/7/21第31頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)分子電荷相反的離子（稱為對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為對離子（反離子）：用于陰離子分離的對離子是烷基銨類，如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等；用于陽離子的對離子是烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉等。2023/7/21第32頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月理論依據(jù)（以反相離子對色譜法為例）：X+——待分離的有機離子，Y-——帶反電荷的對離子對離子的濃度是控制反相離子對色譜溶質(zhì)保留值的主要因素，可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性；平衡常數(shù)取決于對離子和有機相的性質(zhì)。2023/7/21第33頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月分類根據(jù)流動相和固定相的性質(zhì)可分為正相離子對色譜法和反相離子對色譜法。在反相離子對色譜法中（更為常用的離子對色譜法），采用：非極性的疏水固定相，含有對離子的甲醇—水（或乙腈—水）作為極性流動相。注意：對離子濃度是控制反相離子對色譜溶質(zhì)保留值的主要因素，可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性。2023/7/21第34頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月適用：各種強極性的有機酸、有機堿；特別是反相離子對色譜法解決了以往難分離混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子的混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿以及藥物等的分離。另外：借助離子對的生成給試樣引入紫外吸收或發(fā)熒光的基團，提高檢測的靈敏度。2023/7/21第35頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法．基本原理：以離子交換樹脂為固定相，其上可解離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，根據(jù)這些離子對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。親和力大，保留時間長，出峰晚。適用：凡在溶劑中能夠電離的物質(zhì)（無機和有機陰陽離子）通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。2023/7/21第36頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月5、離子色譜法產(chǎn)生背景：離子交換色譜淋洗液幾乎都是強電解質(zhì)，電導(dǎo)比待測離子高兩個數(shù)量級，電導(dǎo)檢測器難以檢測。多數(shù)無機離子沒有紫外吸收，不能檢測。1975年，美國DowChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn).

分離柱+抑制柱+電導(dǎo)檢測器=離子色譜雙柱離子色譜2023/7/21第37頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理：以離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，利用離子交換原理連續(xù)對共存的多種陰離子或陽離子進行分離后，導(dǎo)入檢測裝置進行分析測量。通常以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。雙柱離子交換色譜儀結(jié)構(gòu)：輸液系統(tǒng)（淋洗液貯器、高壓泵）→進樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)（分離柱）→檢測系統(tǒng)（抑制柱、檢測器）→數(shù)據(jù)處理記錄系統(tǒng)（記錄儀、積分儀、計算機）2023/7/21第38頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月離子色譜儀器淋洗液

泵色譜柱檢測器

泵液分離

檢測

記錄F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-進樣閥抑制器檢測池進樣2023/7/21第39頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月分離柱：填充低容量同性離子交換樹脂；如分析陰離子則裝填低容量R—OH，分析陽離子則裝填低容量R—H作用：是基于低容量離子交換樹脂對不同的同性離子的親和力不同而使之彼此分開抑制柱：填充高容量異性離子交換樹脂；如分析陰離子則裝填高容量R—H，分析陽離子則裝填高容量R—OH作用：削減洗脫液造成的本底電導(dǎo)，提高被測組分的靈敏度2023/7/21第40頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月抑制器的作用廢液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity分離柱：ROH；分離NaF、NaCl、NaNO3、Na2HPO4、Na2SO4抑制柱：RH；H+與洗脫液（NaHCO3、Na2CO3）中和，降低背景電導(dǎo)2023/7/21第41頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月以分析陰離子為例，說明為什么要加抑制柱？當待測陰離子從柱中被洗脫下來進入電導(dǎo)池時，要求能檢測出洗脫液中電導(dǎo)的改變，但洗脫液中的氫氧根濃度要比試樣中的陰離子濃度大得多才能使分離柱正常工作，因此與洗脫液的電導(dǎo)值相比，由于試樣進入洗脫液而引起的電導(dǎo)改變就非常小，結(jié)果是用電導(dǎo)檢測器直接測定試樣中的陰離子靈敏度極差，故需加抑制柱以消除洗脫液的本底電導(dǎo)以提高待測離子的檢測靈敏度。2023/7/21第42頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月適用：水溶液中陰離子分析的最佳方法，是目前唯一快速、靈敏和準確的多組分分析的方法；應(yīng)用范圍也在擴散，從無機和有機陰離子到金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、氨基酸、核苷酸等均可用離子色譜法進行分析。單柱型離子色譜法：如果采用低電導(dǎo)洗脫液（如苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽等稀溶液），不僅能有效分離、洗脫各個陰離子，而且背景電導(dǎo)較低，不需抑制柱，稱為單柱型離子色譜法。2023/7/21第43頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月6、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2023/7/21第44頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月固定相：凝膠（具有一定大小孔隙分布）流動相：水（凝膠過濾色譜）、有機溶劑（凝膠滲透色譜）特點：溶劑分子通常是非常小，它們最后被洗脫，故試樣峰全部在溶劑的保留時間（死時間tM）前出峰，它們在柱內(nèi)停留時間短，故柱內(nèi)峰擴展比其它分離方法小得多，所得峰較窄，利于檢測適用：分離相對分子量大的化合物（約為2000以上）；在合適的條件下，也可分離相對分子量小至100的化合物，故相對分子量為100~8×105的任何類型的化合物，只要在流動相中是可溶的，都可用排阻色譜法進行分離。2023/7/21第45頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月局限性：不能分離大小相似、相對分子質(zhì)量接近的分子，例如異構(gòu)體等。只能分離相對分子質(zhì)量差別在10%以上的分子。另外：對于一些高聚物，由于其組分相對分子量的變化是連續(xù)的，雖然不能用排阻色譜進行分離，但可測定其相對分子質(zhì)量的分布（分級）情況，這正是我們想知道的。2023/7/21第46頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月7、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2023/7/21第47頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月離子與非離子酸性液相色譜分離方法選擇分子量<2000水溶性化合物分子量>2000水不溶性化合物不離解離解分子量較大的酚、醚、胺非水溶性高聚物水溶性高聚物分子尺寸不同堿性分配性能有差異多官能團反相離子對色譜陰離子交換色譜陽離子交換色譜凝膠過濾色譜液－液分配色譜吸附色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜非極性極性反相色譜正相色譜2023/7/21第48頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章

液相色譜分析法3.4

液相色譜的固定相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseofHPLC2023/7/21第49頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對色譜法固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/7/21第50頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C（常用、見圖）

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N2023/7/21第51頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及試樣的分析；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2023/7/21第52頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2023/7/21第53頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3.離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）2023/7/21第54頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2023/7/21第55頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3.5液相色譜的流動相

mobilephasesofLC1.流動相特性

（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/7/21第56頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2023/7/21第57頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/7/21第58頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）溶劑的黏度小些為好，否則會降低試樣的擴散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。同時，在同一溫度下，柱壓隨溶劑黏度增加而增加。（5）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2023/7/21第59頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第五章

高效液相色譜法5.2液相色譜中的固定相和流動相2023/7/21第60頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月一、固定相高效液相色譜中的固定相主要采用了8~10mm的微粒固定相，使用微粒填料有利于減小渦流擴散，縮短溶質(zhì)在兩相間的傳質(zhì)過程，提高色譜柱的分離效率。高效液相色譜柱的固定相填料可按材料、性質(zhì)和形狀進行分類：1、按固相材料的剛性程度分類：剛性固體、硬質(zhì)凝膠剛性固體：以硅膠為基體，能承受較高的壓力，可應(yīng)用于任何一種液相色譜方法?？勺鳛橐汗躺V的固定相，也可作為液相色譜的擔(dān)體，還可用于化學(xué)鍵和相色譜的基質(zhì)材料等。硬質(zhì)凝膠：由聚苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成的略具彈性的多孔顆粒，根據(jù)它在高壓下彈性形變程度的大小不同，選擇在不同壓力下使用，這類固定相只應(yīng)用于離子交換色譜和凝膠色譜中。2023/7/21第61頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、按固相填料的疏松程度分類：薄殼型微珠載體、全多孔型載體薄殼型微珠載體：在玻璃珠上沉積一層活性材料，如硅膠、氧化鋁或分子篩等。也稱為表面多孔型載體，其特點：①多孔層厚度小、孔淺、柱效能高；②分配過程在載體表面進行