《發(fā)酵工藝》第一章-菌種選育課件

第一章菌種選育

第一節(jié)工業(yè)常用微生物及要求一、常見微生物

（一）細(xì)菌（bacteria）醋桿菌屬（Acetobacter）乳桿菌屬（Lactobacillus）芽孢桿菌屬（Bacillus）短桿菌屬（Brevibacterium）棒桿菌屬（Corynebacterium）（二）放線菌（actinomyces）最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素（antibiotic）鏈霉菌（Streptomyces）小單孢菌屬（Micromonospora）

（三）霉菌（mould）

1.曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）黃曲霉（A.flavus）

2.青霉屬（Penicillum）桔青霉（P.citrinum）產(chǎn)生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個(gè)單核苷酸。3.根霉屬（Rhizopus

）米根霉（R.oryzae）華根霉（R.chinensis）4.紅曲霉屬（Monascus）（四）酵母（yeast）酵母屬（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2.假絲酵母屬（Candida）產(chǎn)朊假絲酵母（Candidautilis）3.畢赤酵母屬（Pichia）（五）其它微生物1.擔(dān)子菌（basidiomycetes）即菇類（mushroom）2.藻類（alga）幾種菌落

（六）噬菌體（phage）危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。特點(diǎn)：1.體積比細(xì)菌小得多，可以通過細(xì)菌濾器。2.沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。3.營(yíng)專性活物寄生，即只能在特異性寄主細(xì)胞中增殖。烈性噬菌體

——引起寄主細(xì)胞迅速裂解。受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體

——隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。吸附注入核酸合成核酸和蛋白質(zhì)釋放裝配

二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求1.原料廉價(jià)，生長(zhǎng)迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和毒素。

第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育（一）從自然界分離獲得菌種采樣增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)enrichment）提供有利于所需菌株生長(zhǎng)而不利于其它菌型生長(zhǎng)的條件，即讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使篩選變得可能。方法：（1）控制培養(yǎng)基成分（2）控制培養(yǎng)條件（3）抑制不需要的菌類3.純種分離（1）劃線法：簡(jiǎn)單、快捷。（2）稀釋法：菌落單一均勻，適合分離具有蔓延性的微生物。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟一輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟三更換一個(gè)新的無菌營(yíng)養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營(yíng)養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九

在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器——震蕩機(jī)

吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液

取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個(gè)新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4.生產(chǎn)性能的測(cè)定一般采用兩步法：初篩：以量為主復(fù)篩：以質(zhì)為主（二）從自發(fā)突變體中獲得菌株

自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9，自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變稱為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突變稱為正突變。

二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{

誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液

——誘變（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株——篩選

（一）誘變育種的程序選擇出發(fā)菌株制備菌懸液前培養(yǎng)物理誘變誘變變異菌株的分離和篩選化學(xué)誘變（二）突變株的篩選隨機(jī)篩選：傳統(tǒng)方法（1）搖瓶篩選法（2）瓊脂塊篩選法2.理化性篩選方法一：降低終產(chǎn)物濃度a.篩選終產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型

AaBbCcDdE

b.篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株使終產(chǎn)物排出細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度。如：用谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）的生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型（biotindeficiency）進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。

生物素：B族維生素的一種，又稱維生素H或輔酶R。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸單酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（輔基為生物素）催化下合成。

脂肪酸＋甘油磷酸磷脂＋蛋白質(zhì)生物膜因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。

使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法

1.用生理學(xué)手段——

直接抑制膜合成或使膜受缺損如:Glu發(fā)酵中，控制生物素亞適量可大量分泌Glu；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的方法；2.利用膜缺損突變株

——

油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，合成有缺損的膜。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。

控制細(xì)胞膜的滲透性1.通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性2.通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性生物素谷氨酸細(xì)胞膜滲透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸

方法二：篩選抗反饋突變株抗反饋控制突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株。抗反饋控制突變株可以從終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株中獲得。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選誘變淘汰野生型菌株：抗菌素法、菌絲過濾法檢出缺陷型：影印法

夾層法

逐個(gè)檢出法

限量補(bǔ)充培養(yǎng)法確定生長(zhǎng)譜

第三節(jié)生產(chǎn)菌種的改良一、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）

1.標(biāo)記菌株的篩選

2.原生質(zhì)體的制備

3.原生質(zhì)體的融合與再生聚乙二醇（PEG）－脫水劑助融劑

Ca2+－提高融合頻率

4.融合子的選擇二、DNA重組技術(shù)（DNArecombinationtechnology）目標(biāo)DNA片斷的獲得與載體DNA分子的連接重組DNA分子引入宿主細(xì)胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞

第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退衰退原因1.菌種保藏不當(dāng)2.菌種生長(zhǎng)條件沒有得到滿足二、菌種的復(fù)壯

1.純種分離

2.通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯

3.淘汰已衰退的個(gè)體三、菌種保藏

1.原理低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

2.方法（1）斜面保藏法（2）干燥保藏法（3）懸液保藏法（4）冷凍干燥保藏法（5）液氮保藏法（6）低溫保藏法

第五節(jié)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法

1.表面培養(yǎng)

2.固體培養(yǎng)

3.液體深層培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念

指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平

（一）種子制備的工藝流程

搖瓶保藏菌種試管斜面活化茄瓶斜面種子罐固體培養(yǎng)基生理代謝菌種篩選種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)（二）斜面菌種的培養(yǎng)

1.不宜多次移種。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。（三）一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)基特點(diǎn)：

使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（四）二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：

和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（五）種子罐級(jí)數(shù)制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。谷氨酸：一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（二級(jí)發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)→一級(jí)種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（三級(jí)發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)→一級(jí)種子（小罐）→二級(jí)種子（中罐）→發(fā)酵發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響。級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。（六）種齡與接種量

1.種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大。2.接種量移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積

一般：細(xì)菌1％霉菌715％雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：

1.可以縮短生