微生物肺炎克雷伯

微生物肺炎克雷伯第1頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月標本：尿培養(yǎng)基：血平板、MAC（EMB、SS、XLD）KIA、MIU、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對照管試劑：革蘭染液、莢膜染液、V-P試劑、吲哚試劑、95%乙醇溶液器材：孵育箱、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡第2頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月基本特性直接涂片，鏡下觀察。接種：在鏡下觀察細菌的大致形態(tài)及其數(shù)量，直接將標本用接種環(huán)蘸取后接種在血平板、MAC（EMB、SS、XLD）上，進行培養(yǎng)。溫育：37℃孵育18-24小時。第3頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月觀察菌落形態(tài)：血平板上形成圓形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相鄰菌落易于融合，粘液狀，若用接種針蘸取呈長絲狀拽起；MAC上形成乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸的菌落，即紅色或粉紅色、較大、渾濁、凸起、有光澤的粘液型菌落（EMB上是大、粘稠、紅色、易溶于一片的菌落，SS上是紅色或粉紅色、或具有粉紅中心的無色菌落，XLD上呈不透明黃色的菌落）。第4頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月制片1.載玻片準備：玻片先在95％乙醇中去除油污，再在火焰上燒去粘附的乙醇，待冷，做好標記。2.涂片：在潔凈無油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水（或用接種環(huán)挑1-2滴水），用無菌的接種環(huán)挑取少量菌種與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜，涂布面積約1cm2

。3.干燥：涂片在室溫下使其自然干燥，也可以小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

4.固定：手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過微火三次（手指觸摸反面不燙手為宜），待玻片冷卻后再進行染色。第6頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭染色：挑取可疑菌落涂在干凈的玻片上自然晾干，用結(jié)晶紫（1液）覆蓋細菌初染1min，清水沖洗干凈玻片再滴加革蘭染液（2液）媒染1min，清水沖去表面的染液，用95﹪乙醇（3液）脫洗約30s（以乙醇不再有顏色為好），最后用稀釋的復(fù)紅（4液）復(fù)染30s。自然晾干后在顯微鏡下觀察形態(tài)。莢膜染色第7頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月1.染色：玻片置于玻片擱架上，加適量（以蓋滿菌膜為度）草酸銨結(jié)晶紫（或石炭酸復(fù)紅染液）于菌膜部位，染色1-2min。2.水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭（或洗瓶）下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。

3.干燥：自然干燥或用吸水紙吸去涂片上的水，用吸水紙時切勿將菌體擦掉。4.鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察并繪細菌形態(tài)并繪圖于記錄表中。第8頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月鏡下形態(tài)：G-桿菌，卵圓形或球桿狀細菌，長成雙排列，有莢膜，無鞭毛。（如有需要，可進行莢膜染色，染色后菌體呈卵圓形或球桿狀，成雙排列，菌體外繞以明顯的莢膜長較菌體寬2-3倍。）第10頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月生化鑒別定科：氧化酶試驗（-）、IMViC（--++）定屬：KIA（AA+-）、MIU（--+）、O/F（F）、鳥氨酸脫羧酶試驗（-）定種：吲哚（-）編碼鑒定血清學(xué)鑒定第12頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月氧化酶試驗：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C將鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺氧化成紅色或藍色的醌類化合物。主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應(yīng)。

back第13頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月I（吲哚）：有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，與對甲基氨基苯甲醛結(jié)合，生成紅色化合物玫瑰吲哚。主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。M（甲基紅）：某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)，不再繼續(xù)分解，故培養(yǎng)基pH在4.5以下，加入甲基紅指示劑后呈紫紅色（陽性）。有些細菌將分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為醇酮等非酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH在6.2以上，加入甲基紅試劑成橘黃色（陰性）。一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。Vi：某些細菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可進一步脫羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰，后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色胍縮二乙酰，為VP試驗陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可加速其反應(yīng)。一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。C（枸櫞酸鹽）枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中不含任何糖類，枸櫞酸鹽為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。如果細菌能利用銨鹽作為唯一氮源，并能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解枸櫞酸鹽為碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍由綠色變?yōu)樯钏{色，為枸櫞酸鹽利用實驗陽性。若細菌不能利用枸櫞酸鹽為碳源，則細菌不能生長，培養(yǎng)基不變色。back第14頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月KIA（克氏雙糖鐵）克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基，用酚紅作指示劑，在酸性時呈黃色，堿性時呈紅色，培養(yǎng)基中的葡萄糖含量僅為乳糖或蔗糖的1/10，若細菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使ph降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖含量較少，所以生成的少量酸可因接觸空氣而氧化，并因細菌生長繁殖利用含氮物質(zhì)而生成堿性化合物中和，使斜面部分又變成紅色；底層由于處于缺氧狀態(tài)，細菌分解葡萄糖所生成的酸類一時不被氧化而仍保持黃色。若細菌分解葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。細菌產(chǎn)生硫化氫時與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵作用，形成黑色的硫化鐵。主要用于鑒別腸桿菌科細菌。back第15頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月MIU（動力、吲哚、尿酶）培養(yǎng)基為尿素、蛋白胨成分的半固體培養(yǎng)基，指示劑為酚紅。具有色氨酸酶的細菌能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，加入吲哚試劑后，培養(yǎng)基上層的吲哚試劑會變紅；具有尿酶的細菌能分解尿素產(chǎn)氨，使整個培養(yǎng)基變堿呈紅色；有動力的細菌沿穿刺線擴散生長。back第16頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月O/F（氧化、發(fā)酵）不同細菌對不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異。細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參與的，稱為氧化型，氧化型細菌在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖。細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型，發(fā)酵型細菌在有氧或無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。利用此實驗可以區(qū)分細菌的代謝類型。主要用于腸桿菌科細菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。back第17頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸脫羧酶試驗：具有氨基酸脫羧酶的細菌，可分解氨基酸，使其脫掉羧基，生成胺和二氧化碳，稱為脫羧反應(yīng)；并使培養(yǎng)基變堿，可用指示劑顯示出來。最常用的氨基酸有三種，L-賴氨酸脫羧形成尸胺，L-鳥氨酸脫羧形成腐胺，L-精氨酸脫羧形成精胺。本實驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。back第18頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月（吲哚）：有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，與對甲基氨基苯甲醛結(jié)合，生成紅色化合物玫瑰吲哚。主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。back第19頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共23頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項1、標本采集時要用無菌尿杯收集，條件允許時可采集二次晨尿或尿三杯的中尿進行細菌培養(yǎng)。2、標本接種等操作時要注意無菌操作。3、制片采取標本時要選取優(yōu)勢菌落進行涂片，涂片時要適量挑取細菌，涂開并使其均勻分布在載坡片上。4、染色時要正確掌握染色的時間和染液的順序，洗脫時要根據(jù)涂片厚薄靈活掌握，并要盡量淋洗干凈，以免復(fù)染效果不佳。5、鏡檢時要等染片晾干后再在顯微鏡下觀察，以免油鏡觀察用的香柏油會溶解標本。6、生化試驗時參照SOP文件進行操作。第21頁，