金免疫技術(shù)（免疫學(xué)檢驗課件）

第十九章金免疫技術(shù)

（ColloidalGoldImmunoassay）

金免疫技術(shù)是以膠體金（colloidal－gold）作為示蹤標(biāo)記物，用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)，是繼熒光素、放射性核素、酶標(biāo)記技術(shù)之后一常用非放射性核素標(biāo)記技術(shù)。

該類試驗的最大特點是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)。簡便、快速，定性，“床邊檢驗”前言膠體金也稱金溶膠，是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。核心為原子金（Au），外圍雙離子層（內(nèi)層Cl-，外層H+）。膠體金顆粒大小多在1nm～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。第一節(jié)膠體金與免疫金的制備一、膠體金的特性呈色性：不同大小的膠體金呈色有一定差別微小-呈紅色；最小（2-5nm）—橙黃色；中等大小（10-20nm）—酒紅色；較大（30-80nm）—紫紅色。根據(jù)這一特點，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。膠體金優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)二、膠體金的制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)

（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量免疫滲濾試驗（IFA）始創(chuàng)于1985年，最初以酶作為標(biāo)記物。20世紀(jì)90年代初金免疫滲濾技術(shù)得到了快速發(fā)展，用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標(biāo)志物等。目前臨床中用于檢測尿液HCG的“金標(biāo)”早孕診斷試劑就是應(yīng)用這種方法。第一節(jié)斑點金免疫滲濾試驗將抗原或抗體點加在固相載體硝酸纖維素膜上，制成抗原或抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上，依次在膜上滴加標(biāo)本、金標(biāo)試劑及洗滌液等，液體很快滲入吸水材料中，陽性反應(yīng)即在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。一、檢測原理二、方法類型雙抗體夾心法測抗原

間接法測抗體

膠體金反應(yīng)板膠體金標(biāo)記物洗滌液抗原參照品或抗體陽性對照品

三、關(guān)鍵技術(shù)（一）試劑盒組成1將反應(yīng)板平放于實驗臺面上，于小孔內(nèi)滴加含待測抗原的標(biāo)本1～2滴，待完全滲入，待測抗原與膜上的抗體反應(yīng)而結(jié)合在膜上。2于小孔內(nèi)滴加膠體金標(biāo)記抗體試劑1～2滴，待完全滲入，使膠體金標(biāo)記抗體與結(jié)合在膜上的待測抗原反應(yīng)。

（二）技術(shù)要點3于小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入，洗去未結(jié)合的膠體金標(biāo)記抗體。4在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點顯示者判定為陽性反應(yīng)；反之則為陰性反應(yīng)。斑點呈色的深淺相應(yīng)地提示陽性強度。雙抗體夾心法測抗原AB金標(biāo)抗體待測標(biāo)本。第三節(jié)膠體金免疫層析技術(shù)免疫層析技術(shù)（ICA）的原理與滲濾技術(shù)相同，不同點在于液體的移動是基于層析作用的橫流，而不是通過直向的穿流。該方法的試劑為試紙條形式，結(jié)構(gòu)簡單。測定項目包括HCG等激素、腫瘤標(biāo)志物、心血管病標(biāo)志物、傳染病的抗原和抗體等。將各種反應(yīng)試劑分點固定在試紙條上，檢測標(biāo)本滴加在試紙條的一端，通過層析作用使樣品在層析材料上泳動，樣本中的待測物與試紙條上的試劑發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成的復(fù)合物被富集或固定在層析條上的特定區(qū)域（檢測線），無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，通過膠體金的呈色條帶判讀實驗結(jié)果。一、檢測原理

免疫層析試驗的原理與IFA相同，不同點在于液體的移動不是通過直向的穿流，而是基于層析作用橫流。雙抗體夾心法測抗原二、方法類型AGTBC雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標(biāo)本競爭法測抗原AGTCB競爭法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陽性結(jié)果標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陰性結(jié)果

A、B兩端分別粘貼吸水材料，G處為干燥固定在玻璃纖維膜等材料上的膠體金結(jié)合物，T處粘附有已知的抗體或抗原，C處為粘附的質(zhì)控品（抗免疫金抗體），T、C點物質(zhì)往往以直線的形式包被在膜上。三、關(guān)鍵技術(shù)（一）試劑盒組成AGTCBICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊以雙抗體夾心法為例：1將試紙條標(biāo)記線一端浸入待測標(biāo)本中2秒～5秒或在標(biāo)本加樣處加一定量的待檢標(biāo)本，平放于水平桌面。25min～20min內(nèi)觀察結(jié)果。3結(jié)果判斷。（二）技術(shù)要點吸水墊結(jié)合物墊NC膜觀察窗吸水墊待測標(biāo)本層析金標(biāo)抗體包被抗體包被抗金標(biāo)抗體雙抗體夾心法測抗原結(jié)果觀察

陽性陰性無效TC結(jié)果觀察IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深金免疫技術(shù)具有操作簡便、快速以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，除試劑外無需特殊儀器設(shè)備，且試劑穩(wěn)定，便于保存等優(yōu)點，因此特別適用于急診檢驗。目前臨床檢驗中已開展的項目有：HCG、HBV等。新項目正在不斷發(fā)展中。小結(jié)金免疫技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金免疫滲濾試驗是將硝酸纖維素膜上包被抗原或抗體，將其置于滲濾裝置中，進行免疫結(jié)合試驗，抗原抗體反應(yīng)后，形成大分子膠體金復(fù)合物，從而使陽性結(jié)果