生化考研04NucleicAcid(175-8)課件

Chapter4NucleicAcids【目的與要求】1.了解核酸對生物體的重要意義2.了解核酸的分類，掌握兩類核酸的化學(xué)組成特點(diǎn)及核苷酸的結(jié)構(gòu)3.掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，了解DNA雙螺旋的一些特殊的構(gòu)型4.了解RNA的種類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，重點(diǎn)掌握與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的三種RNA的功能5.掌握核酸紫外吸收的特性及熱變性的性質(zhì)，

DNA復(fù)性與分子雜交，掌握DNA的熔解溫度、增色效應(yīng)的概念6.了解酶對核酸的水解作用，限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)及該酶的應(yīng)用7.了解DNA一級結(jié)構(gòu)的測定原理8.了解DNA在生物體內(nèi)的存在方式及由DNA構(gòu)成的染色體的結(jié)構(gòu)1944O.Avery,Pneumococcus1952A.D.HersheyM.Chase32P35S4.1

ComponentsofNucleicAcidsNucleicAcid

Nucleotide

PhosphateNucleoside

PentoseBase一、Base

PyrimidineandPurine

1.PurineAdenine、Guanine2.PyrimidineCytosine、Uracil、Thymine

3.ModifiedBase100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物，植物中有大量5-甲基胞嘧啶

E.coli噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶代替C二、核苷與脫氧核苷糖環(huán)上C1與嘧啶堿N1或與嘌呤堿N9連接核酸中的核苷均為β-型核苷三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯化1.構(gòu)成DNA、RNA核苷酸2.細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物

ATP、GTP、CTP在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用②環(huán)核苷酸

3’、5’-cAMP;3’、5’-cGMP

激素的第二信使，cAMP調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝

cAMP③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物

ppGpp

、pppGpp、ppApp④核苷酸衍生物

HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等的輔助因子在糖蛋白生物合成中，GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是活性的糖基供體UDP-葡萄糖4.2

DNA

PrimaryStructure－SequenceSecondaryStructure－DoubleHelixTertiaryStructure－FoldingConformation一、PrimaryStructure

dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通過3’,5’-磷酸二酯鍵連接起來的線形多聚體。

3’,5’-磷酸二酯鍵是DNA、RNA的主鏈結(jié)構(gòu)

書寫方法：5’→3’5’-pApCpTpG-3’或5’…ACTG…3’

真正代表DNA生物學(xué)意義的是堿基排列順序DNA一級結(jié)構(gòu)二、DNA的二級結(jié)構(gòu)

1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff規(guī)律和DNA鈉鹽纖維的X光衍射分析提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。Chargaff

規(guī)律（1950年）a.DNA中，A=T，G=C，（A+G=C+T）b.DNA堿基組成具有物種的特異性c.DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性d.年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成1.Watson-Crick結(jié)構(gòu)模型（B-DNA）P489★兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸纏成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’★嘌呤與嘧啶堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在雙螺旋的外側(cè)★磷酸與脫氧核糖通過3’5’-磷酸二酯鍵連接，構(gòu)成DNA分子的骨架★大溝：寬、深

小溝：窄、深★雙螺旋平均直徑2.37nm

每圈螺旋含10.4個堿基

堿基堆積距離：0.34nm

螺距：3.32nm★兩條核苷酸鏈依靠堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起

A=T,G=C

2.穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素①堿基堆積力，形成疏水環(huán)境②堿基配對的氫鍵，GC含量越多越穩(wěn)定③磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定④堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性小分子的攻擊三、DNA二級結(jié)構(gòu)的多型性

A-DNA、B-DNA、Z-DNA1.B-DNA

典型的Watson-Crick雙螺旋DNA

右手雙股螺旋

2.A-DNA

右手雙螺旋，外形粗短

RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)3.Z-DNA

左手雙螺旋DNA

天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA4.DNA三股螺旋（H-DNA）和四股螺旋

DNA三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。

TAT、C+GC兩種堿基配對方式

DNA三股螺旋

DNA三股螺旋四、DNA二級結(jié)構(gòu)的不均一性

1.反向重復(fù)序列（回文序列）

DNA序列以某一中心區(qū)域?yàn)閷ΨQ軸，其兩側(cè)的堿基對順序正讀和反讀都相同。較長的回文結(jié)構(gòu)，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和十字結(jié)構(gòu)，與轉(zhuǎn)錄的終止有關(guān)。較短的回文結(jié)構(gòu)往往是限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。

5-GGTACC-33-CCATGG-5反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列2.富含AT的序列很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT

特別是在復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動的Pribnow區(qū)富含AT五、環(huán)狀DNA

某些病毒DNA

某些噬菌體DNA

某些細(xì)菌染色體DNA

細(xì)菌質(zhì)粒DNA

真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA1.環(huán)狀DNA的不同構(gòu)象

松馳環(huán)

解鏈環(huán)和負(fù)超螺旋（1）松弛環(huán)形DNA

線形DNA直接環(huán)化（2）解鏈環(huán)形DNA

線形DNA擰松后再環(huán)化（3）正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA正超螺旋：線形DNA雙鏈（右手螺旋）一端固定，另一端向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)幾圈，再將兩端連接起來，會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋（

DNA雙鏈間），以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。負(fù)超螺旋：線形DNA雙鏈（右手螺旋）一端固定，另一端向松弛的方向旋轉(zhuǎn)幾圈，再將兩端連接起來，會產(chǎn)生一個右旋的超螺旋（DNA雙鏈間）以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫負(fù)超螺旋。2.環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性以260bp組成的線形B-DNA為例，螺旋周數(shù)

260/10.4=25①連環(huán)數(shù)（L）

DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。松馳環(huán)：L=25

解鏈環(huán)：L=23

超螺旋：L=23②纏繞數(shù)（T）

DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)目，用T表示松馳環(huán)T=25

解鏈環(huán)T=23

超螺旋T=25③超螺旋數(shù)（扭曲數(shù)W）松馳環(huán)W=0

解鏈環(huán)W=0

超螺旋W=-2

L=T+W④比連環(huán)差（λ）表示DNA的超螺旋程度，λ=（L-L0）/L0L0是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的λ一般為-0.03－-0.09，平均每

100bp上有3-9個負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起，容易解鏈，有利于DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄。3.拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值①拓?fù)洚悩?gòu)酶I（擰緊）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1②拓?fù)洚悩?gòu)酶II（擰松）能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA

每次催化使L減少2六、染色體結(jié)構(gòu)1.大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體是由4.2×106bp組成的雙鏈環(huán)狀DNA分子，約3000個基因。大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白：每個細(xì)胞H兩個28KD的相同亞基30000個二聚HU兩個各9KD的不同亞基40000個二體聚HLP117KD的亞基20000個單體P3KD的亞基未知大腸桿菌染色體

大腸桿菌DNA（4.2×106bp）與結(jié)合蛋白壓縮成手腳架結(jié)構(gòu)，中心是多種DNA結(jié)合蛋白。DNA上有多個位點(diǎn)與這些蛋白結(jié)合，形成約100個小區(qū)。每個小區(qū)的DNA都是負(fù)超螺旋，兩個端點(diǎn)被蛋白質(zhì)固定，每個小區(qū)相對獨(dú)立。用極微量的DNA酶I水解，只能使少數(shù)小區(qū)的DNA成為松馳狀態(tài)，而其它小區(qū)仍然保持超螺旋狀態(tài)。2．真核生物染色體（組蛋白和DNA組成）組蛋白富含堿性氨基酸，根據(jù)Lys/Arg比值不同，分為H1、H2A、H2B、H3、H4五種，均是單鏈蛋白質(zhì)，分子量11000-21000。

H2A、H2B、H3、H4各兩分子對稱聚集成八聚體。

146bp長度的DNA雙螺旋盤繞在八聚體上形成核小體。核小體間DNA長度15-100bp，其上結(jié)合H1。

2H2A、2H2B、2H3、2H4八聚體146bpDNA核小體串聯(lián)染色質(zhì)折疊

染色體

DNA（直徑2nm）

盤繞組蛋白，結(jié)合H1，壓縮比1/7

核小體螺旋化，壓縮比1/6

螺線管再螺旋化，壓縮比1/40

超螺線管折疊，壓縮比1/5

染色單體總壓縮比：1/8400~1/100004.3RNA的結(jié)構(gòu)一、RNA的一級結(jié)構(gòu)

AMP、GMP、CMP、UMP通過3’、5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體，組成RNA的戊糖是核糖。

RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有堿基。天然RNA分子是單鏈線形分子，部分區(qū)域有

A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。二、tRNA的結(jié)構(gòu)

70－90b，分子量25kd左右，沉降系數(shù)4S左右。有較多稀有堿基。

3’端是CpCpA-OH，用來接受活化的氨基酸，稱為接受末端。

5’末端大多為pG…或pC…

二級結(jié)構(gòu)是三葉草形三、mRNA的結(jié)構(gòu)

1.真核mRNA（1）3’端有20－250核苷酸的polyA

polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA

其polyA較長；衰老的mRNA其polyA較短。

polyA功能：是mRNA進(jìn)入胞質(zhì)的必需形式

提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性（2）5’-帽子帽子結(jié)構(gòu)：

3’-mG-5’ppp5’-Nm-3’-P5’末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個核苷酸相連，形成

5’-5’-磷酸二酯鍵。功能：抵抗5’核酸外切酶降解mRNA

為核糖體提供識別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。

5’-帽子結(jié)構(gòu)2.原核mRNA

由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成，沒有5’帽子和3’polyA。

SD序列：5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處（Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)）。

SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。四、rRNA的結(jié)構(gòu)

rRNA與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體大腸桿菌中有三類rRNA（原核）：

5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA

真核細(xì)胞有四類rRNA：

5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA

23SrRNA能夠催化肽鍵的合成

大腸桿菌5SrRNA結(jié)構(gòu)

16SrRNA4.4核酸的性質(zhì)一、物理性質(zhì)1.性狀

RNA及核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都是白色的粉末或結(jié)晶，DNA則是疏松的石棉樣纖維狀固體2.粘性核酸的水溶液粘度很大，DNA的粘度大于RNA的；核酸變性后，粘度下降。3.溶解性

RNA和DNA都是極性的化合物，微溶于水，不溶于乙醇、氯仿，它們的鈉鹽易溶于水。

DNA和RNA在細(xì)胞內(nèi)都與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白，DNA核蛋白和RNA核蛋白的溶解度受鹽濃度的影響。

DNA核蛋白在1mol/LNaCl溶液中的溶解度比純水中高2倍，在0.14mol/LNaCl溶液中溶的解度最低，幾乎不溶解；而RNA蛋白在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/LNaCl溶解度較大。二、核酸的水解

1.酸堿水解室溫條件下，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C’2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。

DNA穩(wěn)定，保留和傳遞遺傳信息。

RNA是DNA的信使，完成翻譯任務(wù)后降解。2.酶水解

RNA水解酶

RNaseDNA水解酶DNase

核酸外切酶核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶三、解離性質(zhì)

核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。

DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時向正極移動。四、光吸收性堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有較強(qiáng)的光吸收，λmax=260nm1.鑒定純度

純DNA，A260/A280＝1.8（1.65－1.85）

若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解

純RNA，A260/A280＝2.0

若有雜蛋白或苯酚，則A260/A280明顯降低2.含量計(jì)算

1.0ABS相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）

或：20ug/mL核苷酸3.增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：DNA變性時，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：DNA復(fù)性時，摩爾吸光系數(shù)減小五、沉降特性（DNA）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度離心可以將它們區(qū)分開來。這一方法常用于質(zhì)粒DNA

的分離純化。

相對沉降常數(shù)線型雙螺旋分子1.00松馳雙鏈閉環(huán)1.14切刻雙鏈環(huán)1.14單鏈環(huán)1.14線型單鏈1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀1.41坍縮3.0CsCl密度梯度離心六、變性與復(fù)性

1.變性核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈

變性發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)

因素：熱、酸堿（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）現(xiàn)象：吸光度升高，粘度降低，密度升高二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活（1）熔解溫度（Tm）

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈50%時的溫度濃度50ug/mL時，雙鏈DNA的A260=1.00

完全變性A260=1.37

當(dāng)A260增加到最大增加值一半時（1.185），對應(yīng)的溫度即為TmDNA的Tm一般在70－85℃之間（2）影響DNA的Tm值的因素

A.DNA均一性均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。

B.G-C含量與Tm值成正比測定Tm，可推知G-C含量

G-C%=（Tm-69.3）×2.44C.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，Tm越高離子強(qiáng)度與Tm值2.復(fù)性變性的DNA在適當(dāng)（一般低于Tm20－25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。緩慢冷卻時可以復(fù)性，快速冷卻時不能復(fù)性。

DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。

復(fù)性速度可用Co·t衡量

Co是變性DNA的起始濃度mol·L-1t是時間（秒）DNA復(fù)性曲線★1個核苷酸對（AU），若濃度為Co=1.0mmol/L，

50%復(fù)性時，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部復(fù)性，Cot=10-4，t=0.1秒★E.coli4.2×106堿基對，若濃度Co=1.0umol/L，復(fù)性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，115天復(fù)性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，約

5758天★復(fù)性機(jī)制：10-20bp成核，拉鏈

4.5

核酸研究技術(shù)一、核酸的分離純化保持天然狀態(tài)條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌抑制核酸酶1.DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP

溶于水或鹽（1mol/LNaCl），不溶于0.14mol/L

的NaCl中。利用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。

DNA核蛋白可用水飽和酚抽提，去除蛋白質(zhì)，還可用氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)2.RNA的分離純化（mRNA的分離、純化）用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，RNA核蛋白（RNP）在上清液中。

去蛋白：鹽酸胍、苯酚等

必須防止RNA酶對RNA的破壞二、核酸的凝膠電泳

1.瓊脂糖電泳①核酸分子大小遷移率與分子量的對數(shù)成反比②凝膠濃度③DNA的構(gòu)象超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢④電壓5V/cm2.PAGE電泳DNA瓊脂糖電泳-+

EB染色（溴化乙錠）三、限制性核酸內(nèi)切酶

1.限制修飾作用

2.II型核酸內(nèi)切酶限制、修飾活性分開，單體蛋白，輔助因子Mg2+，位點(diǎn)序列反向重復(fù)。

II型酶的切割頻率識別位點(diǎn)：444=256646=4096848=65536限制酶的命名：E.coRI第一位屬名，大寫E第二、三位種名的頭兩個字母，小寫co第四位菌株R第五位從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號

EcoRI酶切位點(diǎn)同裂酶：來源不同的限制性核酸內(nèi)切酶（名稱不同），識別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端

例1：BamHIGG↓ATCC，BstIGG↓ATCC

例2：MboIGAT↓C，Sau3AGAT↓C同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，切割后都產(chǎn)生相同的粘性末端例:BclITG↓ATCA，BglIIAG↓ATCA

四、分子雜交1.SouthernBlottingSouthernBlotting用于DNA之間同源性分析

確定特異性DNA序列的大小和定位

可用DNA或RNA探針DNA樣品→酶切→電泳→變性→轉(zhuǎn)膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影變性（NaOH0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80℃，4-6hs）雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時）2.NorthernBlotting

研究對象是mRNA，探針一般是DNA

總RNA或mRNA在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）五、DNA序列分析

1.化學(xué)裂解法用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一放射性標(biāo)記末端，而另一端是長度只差一個核苷酸的片段群，將此片段群在PAGE上分離。

硫酸二甲酯特異切割：G

甲酸特異切割：G和A

肼在NaCl條件下切割：C

肼在無

NaCl條件下切割：T和C

32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯（G）：*ACTTC