化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀教材課件

上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmunoassay,LIA)是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法不僅具有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,而且還具有分離簡(jiǎn)便,可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析特點(diǎn),使之成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種新的重要的免疫學(xué)分析手段。發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmu2按化學(xué)反應(yīng)類型化學(xué)發(fā)光的分類酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)：豐匯、強(qiáng)生堿性磷酸酶系統(tǒng)：貝克曼非酶促化學(xué)發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)：雅培電化學(xué)發(fā)光：羅氏閃光（Flash）:按發(fā)光持續(xù)時(shí)間發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如：

HRP-Luminol系統(tǒng)

AP-AMPPD系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(InSituInjector)和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）:按化學(xué)反應(yīng)類型3時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光4

發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光(luminescence)。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能可將發(fā)光分為三種類型:1.光照發(fā)光2.生物發(fā)光3.化學(xué)發(fā)光。發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光51.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光

。電子e光子基態(tài)能級(jí)1.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至62.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素(fireflyluciferin)，在熒光素酶(luciferase)的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化螢火蟲(chóng)熒光素(oxyluciferin)，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。2.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素73.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光。化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其機(jī)制為某些化合物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量(即發(fā)光)。3.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光。8化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物直接化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物酶促反應(yīng)的91．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），相應(yīng)發(fā)光底物為：

HRP的發(fā)光底物：價(jià)格低廉、國(guó)內(nèi)技術(shù)成熟

ALP的發(fā)光底物：價(jià)格昂貴、國(guó)內(nèi)無(wú)成熟技術(shù)1．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而10(1)HRP的發(fā)光底物

常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾或其衍生物魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行。(1)HRP的發(fā)光底物常用的底物為魯米諾或其衍生物11（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-12AMPPD

AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15~60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。AMPPDAMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定132．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光，如吖啶酯（acridinium,AE）在含過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。2．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱?43.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖19-1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，成為強(qiáng)氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物153.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。3.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)16酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析（雙抗體夾心法）

酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，17化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)（RIA）、熒光免疫技術(shù)（FIA）和時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)18化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)測(cè)定。其起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代，在國(guó)外化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用處于蓬勃發(fā)展的階段。

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的19化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-17~10-19M/L，遠(yuǎn)高于RIA、EIA、TRFIA。②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好C.V.＜10％。③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期6－12月。⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國(guó)家，CLIA成了取代RIA的首選方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-1720化學(xué)發(fā)光原理

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。抗原：可誘導(dǎo)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗體：由動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的球蛋白。

化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特21化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理22雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠23夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度（X）Hook(前滯)效應(yīng)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度24競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠25競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度線性范圍：

（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（26發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗原磁場(chǎng)中洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗27發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘酶標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物反應(yīng)10分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合28化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等甲狀腺功能檢測(cè)：TT3、TT4、T3、T4、TSH糖尿病檢測(cè)：INS、C-P等腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：AFP、CEA、PSA、fPSA、NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等性腺激素檢測(cè)：E2、Testo、Prog、PRL、FSH、LH、HCG等化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HB29各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方法學(xué)檢測(cè)試劑酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)成熟的增強(qiáng)型魯米諾發(fā)光體系吖啶酯直接化學(xué)發(fā)光半液相反應(yīng)非通用型磁珠，磁珠上標(biāo)記抗體（抗原）電化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)堿性磷酸酶發(fā)光體系儀器性能及參數(shù)自動(dòng)化程度真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候檢測(cè)速度單機(jī)檢測(cè)速度最快一步法：恒速400test/h；兩步法：恒速200test/h，自測(cè)試開(kāi)始第16.5分鐘出第一個(gè)測(cè)試結(jié)果，以后每隔9秒出一個(gè)結(jié)果最高速度200test/h最高速度180test/h100test/h操作模式隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能反應(yīng)杯120個(gè)永久性免維護(hù)反應(yīng)杯一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方檢測(cè)酶促化學(xué)發(fā)光吖啶酯直接30各品牌對(duì)比(續(xù)上表）

豐匯雅培羅氏貝克曼儀器性能及參數(shù)加樣方式四智能加樣手，各試劑獨(dú)立加樣，杜絕交叉污染智能加樣手智能加樣手智能加樣手試劑位83個(gè)，超大獨(dú)立冷藏雙試劑盤獨(dú)立冷藏試劑位獨(dú)立冷藏試劑位獨(dú)立冷藏試劑位孵育方式金屬浴，溫度控制隨意可調(diào)，精度達(dá)±0.1度金屬浴金屬浴金屬浴攪拌方式雙獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手可用方法學(xué)夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法、特殊方法學(xué)可隨機(jī)編輯夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法最小反應(yīng)體積100ul＞200ul＞200ul＞200ul檢測(cè)方法單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)靈敏度10pg/ml10pg/ml10pg/ml10pg/ml一次性耗材無(wú)有≥5元/test有≥5元/test有≥5元/test各品牌對(duì)比(續(xù)上表）

豐匯雅培羅氏貝克曼儀器性能及參數(shù)加樣31豐匯化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀豐匯化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀磁力清洗站磁力清洗站十二步清洗工作站十二步清洗工作站獨(dú)立的攪拌系統(tǒng)獨(dú)立的攪拌系統(tǒng)獨(dú)創(chuàng)永久性反應(yīng)裝置獨(dú)創(chuàng)永久性反應(yīng)裝置高精密度單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)高精密度單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度發(fā)光檢測(cè)儀的核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽(yáng)極上形成較強(qiáng)信號(hào)脈沖信號(hào)相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU