生物選修1-53-血紅蛋白的提取和分離課件

課題3課題背景蛋白質(zhì)是生命活動不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展以及多種生物基因組測序工作的完成，人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時代。對蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用，首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作。血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2和CO2的運(yùn)輸。在本課題中，我們將以血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本技術(shù)?；A(chǔ)知識閱讀教材P64—66，找出下列內(nèi)容：蛋白質(zhì)提取和分離原理是什么

？蛋白質(zhì)提取和分離的方法有哪些？什么是凝膠色譜法？

什么是凝膠電泳法？緩沖溶液的作用是什么？基礎(chǔ)知識一、蛋白質(zhì)提取和分離原理：根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異。如：

1.分子的形狀、大小

2.電荷性質(zhì)和多少

3.溶解度

4.吸附性質(zhì)

5.對其他分子親和力

基礎(chǔ)知識二、蛋白質(zhì)提取和分離的方法：提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

1、凝膠色譜法

（4）原理：（1）概念：基礎(chǔ)知識（3）材料及材料特點(diǎn)（2）別名：（5）過程：閱讀P64教材內(nèi)容，回答相關(guān)問題：_________法1、凝膠色譜法

（4）原理：凝膠是微小的多孔球體，大多數(shù)由多糖類化合物組成，如葡聚糖或瓊脂糖，內(nèi)部有許多貫穿的通道。根據(jù)_____________的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法（1）概念：基礎(chǔ)知識（3）材料及材料特點(diǎn)分配色譜（2）別名：當(dāng)_________的蛋白質(zhì)通過凝膠時，容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程____，移動速度___，而_________的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在____________________移動，路程___，移動速度___，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量分子量小長慢分子量大短快凝膠顆粒的外部間隙混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

基礎(chǔ)知識（4）凝膠色譜法具體過程：洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。基礎(chǔ)知識（5）凝膠色譜法動畫：（3）常用的電泳方法

：閱讀P65教材內(nèi)容，回答相關(guān)問題：（1）電泳概念：基礎(chǔ)知識（2）凝膠電泳法原理：2．凝膠電泳法：（4）實(shí)例

：（1）電泳：基礎(chǔ)知識（2）凝膠電泳法原理：2．凝膠電泳法：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷_____的電極移動③電泳利用了待分離樣品中各種分子__________的差異以及分子本身的______，_____的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的__________，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離________在電場的作用下發(fā)生遷移的過程帶電粒子相反帶電性質(zhì)大小形狀遷移速度（3）常用方法

：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳基礎(chǔ)知識2．凝膠電泳法：SDS（十二烷基硫酸鈉）-聚丙烯酰胺凝膠電泳

測定蛋白質(zhì)分子量（4）實(shí)例

：①原理：②SDS作用：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素為了消除靜電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。它能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，

使電泳遷移率完全取決于分子的大?。?）凝膠電泳原理示意圖影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素知識拓展

決定運(yùn)動方向電場作用力形成阻力決定運(yùn)動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√基礎(chǔ)知識三、緩沖溶液1．作用：2．緩沖溶液的配制：使用比例能夠抵制_____________對溶液的_______的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值通常由________緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的____________就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。1～2種2、在血紅蛋白整個實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)思考：1、你知道的人體血液中的緩沖對有哪些？緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽溶解于水中組成。人體血液中的緩沖對有H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等實(shí)驗(yàn)操作閱讀P66—69教材內(nèi)容，回答相關(guān)問題：一、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？二、從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的流程有哪些環(huán)節(jié)？三、血紅蛋白的進(jìn)一步純化用什么方法？包括哪些步驟？四、進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定使用最多的方法是什么？實(shí)驗(yàn)操作一、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為：樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定等幾個步驟。思考：△是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？不是?！髂阏J(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大最好選用哺乳動物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。△血液組成成分1.血液由______和________兩部分組成。2.血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞中含量最高的化合物是_____________。3.該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的______________________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素思考：實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程樣品處理及粗分離純化純度鑒定1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離1.洗滌紅細(xì)胞①目的：②方法：③洗滌干凈的標(biāo)志：去除_________________________________上清液沒有黃色雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次△加入物質(zhì)及操作目的分析：蒸餾水的作用是________________________。加入甲苯的作用是______________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀_____________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離2.釋放血紅蛋白思考：△釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞中加入了哪些物質(zhì)？加入了蒸餾水、甲苯實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離3.分離血紅蛋白將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:最上層：_________的甲苯層第2層：____________的沉淀層，___色薄層固體第3層：__________的水溶液層，__________的液體最下層：其它雜質(zhì)的___________沉淀層閱讀P67教材內(nèi)容，回答相關(guān)問題：無色透明脂容性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色濾紙過濾脂類物質(zhì)分離過程圖解紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機(jī)溶劑血紅蛋白實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離3.分離血紅蛋白去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離4.透析血紅蛋白透析的目的：透析袋的材料及特性：硝酸纖維素；半透性透析液及作用：pH＝7的磷酸緩沖液

；維持血紅蛋白的正常特性

透析的過程：閱讀P67教材內(nèi)容，思考問題：20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL1mL實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（一）樣品處理及粗分離4.透析血紅蛋白透析的過程：12h—300mL實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作閱讀P67—69教材內(nèi)容，思考問題：凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括哪幾個步驟？凝膠色譜柱裝填使用的材料和方法步驟是什么？凝膠色譜柱裝填的注意事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：凝膠色譜柱裝填使用的材料：1、制作色譜柱；2、裝填色譜柱；3、樣品加入和洗脫交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作2、凝膠色譜柱裝填的方法步驟：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作凝膠色譜柱裝填的注意事項(xiàng)：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡(氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果)；洗脫液不能斷流(平衡凝膠使凝膠裝填緊密)。實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫閱讀P68—69教材內(nèi)容，了解加樣和洗脫的步驟a．加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的_______緩慢下降到與___________平齊，關(guān)閉出口。緩沖液凝膠面實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫⑴加樣實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫b．加樣時，用____小心地將1mL透析后的樣品加到______的頂端，注意不要破壞_____。吸管色譜柱凝膠面⑴加樣c．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入________內(nèi)。凝膠層實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫⑴加樣注意正確的加樣操作：

①不要觸及破壞凝膠面

②貼壁加樣

③使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動加入______________，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液。磷酸緩沖液實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（二）血紅蛋白的純化——凝膠色譜操作3、樣品的加入和洗脫⑵樣品的洗脫：△色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。在鑒定的方法中，使用最多的是______________。純化實(shí)驗(yàn)操作二、從紅細(xì)胞中提取和分離血紅蛋白的流程（三）純度鑒定：判斷_____的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（動畫演示）操作提示1．紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；離心速度過高和時間過長會使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。2．色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用沸水浴加熱，加速膨脹。3．凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。4．蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？結(jié)果分析與評價由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？結(jié)果分析與評價如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？結(jié)果分析與評價血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定知識總結(jié)1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)練習(xí)鞏固2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較練習(xí)鞏固3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長D防止血液凝固練習(xí)鞏固5.下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述正確的是多選

A.樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B.通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C.可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D.可通過SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度練習(xí)鞏固6.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是

A.可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料

B.用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞

C.血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時間離心

D.洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液練習(xí)鞏固7.樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A.加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B.加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C.等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D.用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面練習(xí)鞏固8.在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A.氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B.氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動C.氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D.氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不緊密練習(xí)鞏固9.選用紅細(xì)胞作分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，下列是其優(yōu)點(diǎn)的是多選A.血紅蛋白是有色蛋白B.紅細(xì)胞無細(xì)胞核C.紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D.紅細(xì)胞DNA含量高練習(xí)鞏固10.下列操作正確的是A.分離紅細(xì)胞時采用低速長時間離心B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心D.透析時要用20mmol/L的磷酸緩沖液，透析12h練習(xí)鞏固11.下面關(guān)于對血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是多選A.采集血樣后要高速短時問離心獲得血細(xì)胞B.洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血漿蛋白無法除凈。C.在蒸餾水和甲苯的作用下，細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白D.釋放血紅蛋白后再經(jīng)過離心，就可以使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開來練習(xí)鞏固12.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程中，分析無誤的是A洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機(jī)鹽B洗滌時離心速度過小，時間過短，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果C洗滌過程選用0.1%的生理鹽水D透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)下練習(xí)鞏固13、紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳。我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：（1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：_________、_______

、_____和__________

。（2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。①加入檸檬酸鈉的目的是________________________

。②以上所述的過程即是樣品處理，它包括_____________

、_____________

、收集血紅蛋白溶液。樣品處理粗分離純化純度鑒定防止血液的凝固

紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放將樣品中分子量較小的雜質(zhì)蛋白除去透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是_________________________