免疫學(xué)技術(shù)-酶免疫技術(shù)（臨床免疫檢驗(yàn)課件）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)案例酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是于1971年分別由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者報(bào)道的一種酶標(biāo)固相免疫測定技術(shù)，這種技術(shù)出現(xiàn)后，不但成為了一種非常簡單的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)那么什么是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，基本原理是什么，有哪些方法類型基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）是將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，對標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量方法類型雙抗體夾心法雙位點(diǎn)一步法酶免疫技術(shù)檢測抗原的方法檢測抗體的方法競爭法間接法雙抗原夾心法競爭法捕獲法

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法

酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法

固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體EE底物E競爭法

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE捕獲法臨床應(yīng)用蛋白質(zhì)測定病原微生物測定藥物測定傳染病的診斷各種免疫球蛋白補(bǔ)體腫瘤標(biāo)志物結(jié)核桿菌幽門螺旋桿菌地高辛病毒性肝炎風(fēng)疹病毒輪狀病毒0102酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的類型

小結(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理CA思考題試述臨床哪些指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫法？酶聯(lián)免疫法有哪些優(yōu)勢？酶免疫技術(shù)概述

案例酶免疫技術(shù)是三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)之一1971年由Engvall和Perlmann及Vanweeman和Schuus兩組學(xué)者分別用酶代替放射性核素制備了酶標(biāo)記試劑，創(chuàng)立了酶免疫技術(shù)，1975年問世的雜交瘤技術(shù)進(jìn)一步促進(jìn)了酶免疫技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)前酶免疫技術(shù)與形式各異、各具特點(diǎn)和用途的定位、定量和超微量測定的標(biāo)記免疫分析技術(shù)融合發(fā)展，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)科的各個領(lǐng)域酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)01040203標(biāo)記試劑能夠長時間穩(wěn)定靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好操作簡便、對環(huán)境沒有污染易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法技術(shù)分類均相異相液相酶免疫測定固相酶免疫測定酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定標(biāo)記酶的要求測定方法簡便易行敏感、精確活性高純度高作用專一性強(qiáng)性質(zhì)穩(wěn)定易與抗原或抗體偶聯(lián)酶和底物對人體無害且價(jià)廉易得常用的酶和底物辣根過氧化物酶（HRP）常用的第一種酶是辣根過氧化物酶是由無色的糖蛋白和亞鐵血紅素結(jié)合而成的復(fù)合物輔基是酶的活性中心，主酶與活性無關(guān)純度用RZ（純度數(shù)）表示RZ值僅說明血紅素基團(tuán)在HRP中的含量，與酶活性無關(guān)HRP是目前在酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記酶常用的酶和底物反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色HRP的常見底物鄰苯二胺四甲基聯(lián)苯胺測定波長492nm缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，具有致癌性反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色測定波長450nm穩(wěn)定，無致癌性缺點(diǎn)：水溶性差ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物ALP底物經(jīng)AlP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm

常用的酶和底物堿性磷酸酶是一種磷酸酯水解酶從大腸桿菌或小牛腸粘膜提取對-硝基苯磷酸酯（pNPP）制備酶標(biāo)記抗體（抗原）的方法制備酶標(biāo)記抗體(抗原）的方法制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則戊二醛交聯(lián)法改良過碘酸鈉法塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板小試管和小珠三種微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜等固相載體0102常用的酶及底物

小結(jié)酶免疫技術(shù)基礎(chǔ)知識思考題BA試述酶聯(lián)免疫試劑盒包括哪些組成部分，簡要說明其作用。膜載體酶免疫技術(shù)

案例固相膜免疫測定與ELISA相類似，其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相，標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子，如彩色乳膠和膠體金等，常用的固相膜是硝酸纖維素膜。那么：什么膜載體酶免疫技術(shù)呢該技術(shù)的檢測原理是什么？有哪些方法類型呢膜載體酶免疫技術(shù)膜載體酶免疫技術(shù)膜載體酶免疫技術(shù)是一種以膜為載體的酶免疫技術(shù)以膜為固相載體將蛋白質(zhì)直接吸附或通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至膜載體表面，形成固相抗原，加入特異性抗體和酶標(biāo)記抗抗體溫育后在膜表面形成免疫復(fù)合物，加底物顯色在膜表面形成有色斑點(diǎn)或條帶判定檢測結(jié)果方法類型斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)030102斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)將NC膜封于塑料小盒中先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗體，干燥后封閉再依次加入待測標(biāo)本、酶標(biāo)抗體最后加入底物，陽性時可在膜上出現(xiàn)有色斑點(diǎn)免疫印跡試驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)膜載體結(jié)果觀察包被與封閉抗原抗體反應(yīng)用PBS浸濕5-10分鐘，將適當(dāng)濃度包被溶液加在相應(yīng)位置，室溫靜置1-2小時。用牛血清白蛋白或脫脂奶室溫下封閉過夜常用微孔濾膜是一種多孔性薄膜過濾材料包括固相膜和擴(kuò)散膜包被好的NC膜加入待檢標(biāo)本、酶標(biāo)記物等，讓抗原抗體反應(yīng)并達(dá)到平衡可肉眼觀察顯色區(qū)帶直接獲得定性結(jié)果，通過圖像掃描可定量分析臨床應(yīng)用自身抗體譜的免疫印跡條過敏原特異性檢測的試劑條0102臨床應(yīng)用01020304膜載體酶免疫技術(shù)的方法類型膜載體酶免疫技術(shù)的操作要點(diǎn)膜載體酶免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用

小結(jié)膜載體酶免疫技術(shù)的檢測原理BA思考題試述什么是westernblot?它的優(yōu)點(diǎn)和臨床應(yīng)用有哪些？BAS-ELISA案例1936年，兩位德國科學(xué)家從煮熟的鴨蛋黃中分離提取出一種結(jié)晶物質(zhì)，是酵母生長所必需的，稱之為“生物素”。生物素分子有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中咪唑酮環(huán)是與親和素結(jié)合的主要部位，噻吩環(huán)C2上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。親和素也稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，生物素與親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用。生物素-親和素系統(tǒng)(Biotin-Avidin-System，BAS)是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。近年來大量研究證實(shí)，生物素-親和素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合，生物素與親和素之間高親合力的牢固結(jié)合以及多級放大效應(yīng)，已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)

生物素-親和素系統(tǒng)生物素-親和素系統(tǒng)(Biotin-Avidin-System，BAS)是一種以生物素和親和素具有的多級放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

生物素-親和素系統(tǒng)基本類型及原理反應(yīng)層次直接法間接法BA-ELISAAg-（Ab-B）-A＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-A＊BAB-ELISAAg-（Ab-B）-A-B＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-A-B＊ABC-ELISAAg-（Ab-B）-AB＊CAg-Ab1-（Ab2-B）-AB＊CA＊為標(biāo)記親和素B＊為標(biāo)記生物素

BA-ELISA檢測抗原

BA-ELISA檢測抗體

BAB-ELISA

ABC